豚鼠甲流H1N1感染模型的建立及激素甲强龙对感染干预作用的探讨

占玲俊，鲍琳琳，邓 巍，张鹏俊，吕 琦，马春梅，曹 彬，秦 川

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021;2.首都医科大学附属北京市朝阳医院呼吸疾病研究所，北京 100020)

豚鼠甲流H1N1感染模型的建立及激素甲强龙对感染干预作用的探讨

占玲俊1，鲍琳琳1，邓 巍1，张鹏俊2，吕 琦1，马春梅1，曹 彬2，秦 川1

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021;2.首都医科大学附属北京市朝阳医院呼吸疾病研究所，北京 100020)

目的 建立豚鼠的甲流感染模型并评价激素甲强龙对感染的干预作用。方法 将4～6周龄雌性SPF级豚鼠(200～300)g分为4组：正常对照组，模型组，甲强龙1组和甲强龙2组，除对照组外，豚鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻接种A/California/7/2009(CA7)病毒，分别于攻毒后3 d和5 d给予激素甲强龙，大剂量3 d后1/4剂量给3 d，检测豚鼠感染的多项指标，观察期为14 d。结果 成功建立了豚鼠的甲流感模型;甲强龙1组豚鼠肺部炎症减轻较模型组和甲强龙2组明显，存活率较这两组均降低，甲强龙2组肺部炎症较模型组减轻，而较甲强龙1组重，豚鼠的存活率较这两组均无差异。结论 豚鼠能感染A/California/7/2009(CA7)病毒，感染后5 d比感染后3 d开始给予激素的干预效果好。

甲流;模型，豚鼠;甲强龙

近年来，豚鼠作为流感的易感动物应用越来越多，主要用于流感的感染和传播机制研究［1-3］。甲流的小鼠和雪貂感染模型已相继建立［4，5］，豚鼠对甲流H1N1是否易感，并进行多种动物的比较研究，值得探讨。

流感感染常引起病毒性肺炎，并能继发细菌性肺炎，严重威胁患者生命。病毒感染性肺炎的治疗不但要在感染早期积极抗病毒，而且要注意预防机体出现过亢的炎症反应。在重症感染中，炎症反应参与了这一过程并发挥了重要作用，而激素类药物迄今仍是最有效的缓解炎症药物，作为肺部感染的辅助治疗受到了广泛关注。但是激素在不同程度流感感染中的治疗作用，特别是其应用指征、治疗剂量以及给药时相和疗程等方面一直存在争议。

因此，本研究中我们利用本室已有的甲流毒株建立豚鼠甲型H1N1动物模型，探讨糖皮质激素甲强龙对甲型H1N1流感的病毒性肺炎的干预作用，为临床上甲型H1N1流感的病毒性肺炎和继发感染性肺炎提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

H1N1病毒株为 A/California/7/2009，其 HA效价都为 1∶32，CA7106TCID50/0.2 mL。SPF 级雌性哈氏天竺豚鼠，4～6周龄，体重(200～300)g，由中国药品生物制品检定所提供。犬肾MDCK传代细胞系本所储存细胞，常规方法传代培养。0.01 mol/L，pH 7.2，PBS配制成0.1%的豚鼠红细胞悬液，4℃保存。RVC-II型独立送风隔离笼具 Tecniplast公司;RNeasy mini kit购自Qiagen公司;AMV反转录酶及 RNA酶抑制剂购自 Promega公司;Taq plus DNA聚合酶及dNTP购自TaKaRa公司，ABI power SYBR Green Mix购自ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠的感染和给药：实验在本所的ABSL-3实验室中进行。将20只4～6周龄雄性豚鼠按体重均衡的原则分为正常对照组、模型组、甲强龙1组和甲强龙2组。每组5只，每笼2～3只。标记后分别称重。病毒液的滴度为106TCID50。将豚鼠经乙醚吸入麻醉后，滴鼻接种病毒，每只豚鼠150 μL/每鼻孔，共 300 μL，对照组小鼠经鼻腔滴入等量的生理盐水。独立送风隔离笼具中正常饲养。实验的观察期为14 d。甲强龙1组和2组的豚鼠分别于感染后3 d和5 d开始连续使用激素甲强龙，采用腹腔注射的方法，先用8.75 mg/kg/d的大剂量3 d后改用2.12 mg/kg/d的1/4量3 d。

1.2.2 临床观察和取样：每日观察记录豚鼠的活动状态及临床表现，存活情况，0、3、5、8、14 d 称量体重。取豚鼠感染后的鼻腔灌洗液，分0、3、5和8 d采样。无菌采集濒死和处死豚鼠的脏器：心、肝、脾、肺、肾、小肠、气管和脑，置-80℃保存备用。

1.2.3 豚鼠鼻腔灌洗液和脏器病毒滴度的测定：鼻腔灌洗液100 μL直接接种于单层培养MDCK细胞的96孔细胞培养板上，每个样品接种4个重复孔，CO2培养箱中37℃静止培养，观察记录各孔细胞病变(CPE)情况，连续观察 2～3 d。按照 Reed-Muench方法计算灌洗液中病毒的TCID50。

用DMEM液按1∶10(M/V)将豚鼠脏器研磨成乳剂，5 000 r/min离心10 min，上清液加双抗(青霉素、链霉素各 1 000 IU/mL)4℃过夜，7 000 r/min，离心20 min，取上清液，-70℃保存。组织上清液10×连续稀释至10-8，接种于单层培养MDCK细胞的96孔细胞培养板上，每个稀释度接种4个重复孔，CO2培养箱中37℃静止培养，观察记录各孔细胞病变(CPE)情况，连续观察 2～3 d。按照 Reed-Muench方法计算感染豚鼠脏器病毒的TCID50。

1.2.4 病理学检查：无菌取濒死豚鼠的脏器心、肝、脾、肺、肾、小肠、气管和脑，用甲醛固定、石蜡包埋、常规HE染色，光镜下观察其病理变化。

1.2.5 Real time RT-PCR检测：根据中国CDC公布的甲流H1N1流感病毒HA基因序列设计一对引物：SW-H1 F786：5’-AATAACATTAGAAGCAACTG G-3’;SW-H1 R920：5’-AGGCTGGTGTTTATRGCA CC-3’。扩增片段的大小为153 bp。按RNeasy minikit方法提取RNA，并进行反转录。将逆转录产物2 μL，加至20 μL Power SYBR Green定量 PCR 反应体系中，瞬时离心后置 StepOne定量 PCR仪进行扩增。扩增条件：94℃ 3 min预变性，94℃ 30 s变性，52℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，35循环，72℃延伸7 min，95℃ ，15 s，60℃，1 h，95℃，15 s。标准品的制作方法见参考文献［1，7］。

1.2.6 数据统计方法：豚鼠的体重变化用体重百分比表示，即以豚鼠当天体重减去其第0天的体重的差值作分子，以第0天的体重作分母，记录为平均体重变化百分比±标准差，数值采用每组的平均数。豚鼠的存活率即存活只数与该组原总只数的百分比值。

2 结果

2.1 临床症状

正常对照组，模型组，甲强龙1组和2组豚鼠的毛发，活动度未见明显异常，甲强龙1组有3只豚鼠出现体重下降，有2只极度消瘦，其中1只于感染后7 d死亡，另1只于感染后第8天濒死给予解剖(表1)。体重变化情况见图1。

2.2 鼻腔灌洗液和组织脏器的病毒分离

感染后每天取豚鼠的鼻腔灌洗液，濒死或处死的豚鼠做病毒滴度培养，用Reed-Muench法计算样品中病毒含量(TCID50/0.02 mL)。模型组和甲强龙1组和2组的鼻腔灌洗液能分离到病毒，而组织脏器中均未分离到活病毒(表2)。

2.3 感染豚鼠的鼻腔灌洗液和脏器的real time RT-PCR检测结果

鼻腔灌洗液和各脏器样品进行流感病毒定量RT-PCR扩增，鼻腔灌洗液中能扩增出病毒(图2)，而组织脏器中未扩增出病毒。

表1 豚鼠的存活情况Tab.1 Survival of the guinea pigs

2.4 感染小鼠病理变化结果

感染的小鼠除肺脏以外，其他组织均无病变。肺组织病理结果如下：对照组无病变。模型组中有2例(2/5)为重度肺炎，3例(3/5)为弥漫性间质性肺炎。肺病理切片可见肺静脉及肺泡壁毛细血管明显扩张充血，部分肺静脉壁及周围组织明显水肿，局部支气管及肺泡上皮细胞坏死、脱落，肺泡腔内可见大量渗出和漏出的红细胞、水肿液、炎细胞及坏死脱落的上皮细胞碎屑。甲强龙1组中4例未见明显异常，1例(1/5)有重度肺炎。甲强龙2组有1例(1/5)弥漫性间质性肺炎，4例(4/5)局灶性间质性肺炎。病理切片可见局灶性支气管周围炎细胞浸润，肺间隔增宽(图3，见彩插2)。

图1 豚鼠感染后体重变化百分比Fig.1 Percentage of postinfection weight changes of the guinea pigs

3 讨论

小鼠和雪貂的甲流模型相继建立，但是豚鼠的甲流模型罕有报道。豚鼠作为流感的实验动物有其独有的优势：豚鼠是实验动物，遗传背景相对清楚;豚鼠能感染人源和禽源A型流感病毒如H5N1，H1N1，H3N2，模拟哺乳动物感染流感病毒［1，3］。由于豚鼠的成本较低，占有空间小，相关免疫和生化试剂易获得，因此豚鼠逐渐替代雪貂进行较大规模的动物易感性和抗病毒治疗等机制的研究;豚鼠是模拟流感传播的理想动物模型［1］。

豚鼠感染甲流106TCID50后，模型组，甲强龙1组和2组的鼻腔灌洗液能分离到活病毒，并且结果与的病毒载量吻合，提示豚鼠能感染上CA7 H1N1，豚鼠的甲流模型成功建立。

病理结果显示：模型组肺脏病变的程度重且范围广，在感染后第3天给予甲强龙后，病变明显减轻或消失;在感染后第5天给予甲强龙后，病变亦减轻，但减轻程度不如甲强龙3天给药组。病理结果虽然提示有病理损伤，但是综合病毒分离和病毒载量的结果可以看出肺部的病理损伤极有可能不是病毒的直接作用引起，而是间接的免疫损伤。

激素治疗后，相比较模型组，肺部炎症都有减轻，但是感染后3 d开始使用激素，虽然可以减轻肺部炎症，但可能会影响机体的整体机能，最后导致消瘦死亡。而感染后5 d开始使用激素虽然肺部炎症减轻不如甲强龙1组，但对豚鼠整体机能影响不明显。可见，对于豚鼠，早用激素弊大于利，而稍晚用激素，利大于弊。这对于临床上重症病毒性肺炎的治疗的剂量和时相有一定的指导意义。

但是，模型组临床表现未出现异常，未出现感染死亡现象;甲强龙1组，于感染后5 d激素使用3 d后体重明显下降，并有2只出现严重消瘦，其中一只在感染后7 d濒死并予解剖，一只于感染后8 d死亡;激素治疗2组，无异常临床表现，无感染致死的豚鼠。组织脏器中并未分离到活病毒，病毒载量结果也为阴性，提示病毒的感染较轻，并未直接引起组织病变。

可见，本实验构建的豚鼠感染症状较轻，监测的指标未见明显异常，后期的实验可以考虑加大攻毒剂量，并且增加检测指标，比如体温等，并且此次病理检测多在流感的恢复期，需增加急性期采样检测。本实验由于是初步探讨甲强龙对豚鼠甲流H1N1模型和的干预作用，所以每组的动物数量不够大，后期的实验可以加大每组动物只数。另外，可以根据实验目的建立重症流感，以及在此基础上建立继发性细菌性肺炎，并评价激素甲强龙在治疗中的时相和疗效。

表2 豚鼠鼻腔灌洗液的病毒分离(n=5)Tab.1 Virus isolation of nasal wash collected from the guinea pigs

图2 豚鼠感染后鼻腔灌洗液的病毒定量结果Fig.2 Real time PCR quatification of the virus in nasal wash collected from infected guinea pigs

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［4 ］ Munster VJ，de Wit E，van den Brand JMA，et al.Pathogenesis and transmission of swine-origin 2009 A(H1N1)influenza virus in ferrets［J］.Science，2009，325(5939)：481-483.

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Establishment of a Guinea Pig Model of Influenza A(H1N1)Virus Infection and Effect of Methylprednisolone Intervention

ZHAN Ling-jun，BAO Lin-lin，DENG Wei，ZHANG Peng-jun，LV Qi，MA Chun-mei，CAO Bin，QIN Chuan
(1.Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China;2.Beijing Chaoyang Hospital，Beijing Institute of Respiratory Medicine，Capital Medical University，Beijing 100020，China)

Objective To establish a guinea pig model of influenza A/California/7/2009(CA7)virus infection and evaluate the intervention with hormone methylprednisolone for viral pneumonia due to this infection.Methods Female Hartley strain guinea pigs(200-300 g)were divided into four groups： control，model，methylprednisolone group 1 and methylprednisolone group 2.The animals were anesthetized by inhalation of ether and inoculated intranasally inoculated with 0.3 mL of virus CA7.Methylprednisolone was administered beginning at postinfection day 3 or 5，recommended dose lasting for 3 days and then quarter of recommended dose for another 3 days.The animals were observed daily for 14 days for clinicalsigns of infection and survival.Results The guinea pig model for A/California/7/2009(CA7)virus infection was established successfully.The lung inflammation of methylprednisolone group 1 was alleviated compared with that of both model group and methylprednisolone group 2，but the survival rate was lower compared with that of both two groups.The lung inflammation of methylprednisolone group 2 was alleviated in comparison with that in the model group but aggravated compared with that of methylprednisolone group 1，while the survival rate was not affected.Conclusion Guinea pigs can be infected with influenza A virus A/California/7/2009，and it is better to administer methylprednisolone on dpi 5 than dpi 3.

Influenza A virus，A(H1N1);Guinea pig，model;Methylprednisolone

R373;R33

A

1671-7856(2011)02-0016-04

2010-09-18

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.04

科技重大专项-艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治：2009ZX10004-402;卫生公益性行业科研专项项目：200802036;中央级公益性科研院所基本科研业务费：DWS200810，国家自然科学基金重点项目：81030032。

占玲俊，助理研究员，研究方向：病毒的感染与免疫。

秦川，教授，博士生导师。E-mail：chuanqin@vip.sina.com。