普洱茶茶色素提取工艺条件的响应面分析及其抗氧化性活性研究

杨新河，李 勤，黄建安，陆 英，沈 智，刘仲华,*

(1.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；2.孝感学院生命科学技术学院，湖北 孝感432000；3.湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128)

普洱茶茶色素提取工艺条件的响应面分析及其抗氧化性活性研究

杨新河1,2，李 勤1,3，黄建安1,3，陆 英1,3，沈 智1,3，刘仲华1,3,*

(1.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；2.孝感学院生命科学技术学院，湖北 孝感432000；3.湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128)

目的：优化普洱茶茶色素的提取工艺及研究其抗氧化性活性。方法：以与蒸馏水的色差作为普洱茶茶色素提取的评价指标，在单因素试验基础上，利用Box-Behnken中心组合试验和响应面分析法，对普洱茶茶色素提取工艺参数进行优化；以清除1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH自由基)的能力评价普洱茶茶色素的抗氧化性活性。结果：普洱茶茶色素提取的最佳工艺条件为液料比45:1(mL/g)、提取温度100℃、提取时间150min、色差52.97，高出单因素试验和Box-Behnken组合中的最高色差4.73%；普洱茶茶色素清除DPPH自由基的IC50值30.83μg/mL。结论：采用响应曲面法对普洱茶茶色素提取条件进行优化可行；普洱茶茶色素具有良好的抗氧化作用，可作为天然抗氧化剂进一步开发和利用。

普洱茶；茶色素；提取；响应面分析；抗氧化性活性

普洱茶是以云南省一定区域内的云南大叶种晒青毛茶为原料，经过后发酵加工成的散茶和紧压茶[1]。研究表明，普洱茶具有降血脂、降血糖、抗突变、防癌及防治心血管疾病等功能[2-13]。普洱茶药理作用的主要成分是茶多酚、茶色素和茶多糖等[1]。普洱茶茶色素是指从普洱茶中提取的一类水溶性酚性色素，属于天然色素，包括茶黄素类(TFs)、茶红素类(TRs)和茶褐素类(TBs)，其中茶褐素类是其主体成分。而茶褐素类比茶红素类更复杂，为高聚物，极性很大，分离纯化的难度极大，根本不清楚其组成、性质及分离制备等，急需开展茶褐素类的相关研究。现有一些研究初步表明：普洱茶茶色素具有防癌抗癌、防紫外线照射、抗动脉粥样硬化等药效，产品的开发可广泛用于医药和食品工业[14]。但普洱茶茶色素的药理作用机理并不清楚、新的功效有待挖掘，应用领域需要拓展。因此，如何有效充分提取普洱茶茶色素是深入研究其化学成分、构效关系及产生更大经济效益等诸多方面的前提。

目前，茶叶中色素类物质TFs、TRs和TBs的含量采用系统分析法测定[15]，但此方法不能够对浸提色素的效果进行快速评价。而色差E测量原理采用最广泛使用于测量物体色调的CIEL*a*b*颜色空间(即色度空间)系统。所有的颜色可用L*、a*、b*三个轴的坐标来定义。L*为垂直轴，代表明度，其值从底部0(黑)到顶部100(白)。a*代表红绿轴上颜色的饱和度，其中－a*为绿、+a*为红。b*代表蓝黄轴上颜色的饱和度，其中－b*为蓝、+b*为黄。a*、b*都是水平轴。2个颜色之间的E=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2。测定溶液与蒸馏水标准液的E值，则E值的大小反映了溶液色素质量浓度的大小，从而可以简单快速评价不同浸提条件对提取色素效果的影响。本实验采用E值作为普洱茶茶色素提取的评价指标，研究热水提取茶色素过程中液料比、提取温度和提取时间对茶色素提取的影响。在此基础上，利用响应面分析法对其提取工艺参数进行优化，得出普洱茶茶色素水提法的最佳工艺条件；同时利用清除1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH自由基)法研究普洱茶茶色素的抗氧化作用，旨在为深入研究普洱茶茶色素提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

龙润普洱茶(2007年) 云南龙润茶业集团。

1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH自由基) 日本东京化成工业株式会社；其他试剂皆为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

精密电子天平 瑞士Startorius公司；恒温水浴锅北京国华医疗器械厂；SMY-2000ST测色色差计 北京盛名扬科技开发有限责任公司；Rotavapor R-200型旋转蒸发器 瑞士B公司；循环水式多用真空泵 河南巩义英峪予华仪器；Modulyod-230型冷冻干燥机 美国热电公司；UV-2550型紫外分光光度计 日本岛津仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 普洱茶茶色素TFs、TRs和TBs的含量测定

采用系统分析法[15]测定。

1.3.2 普洱茶茶色素的E测定方法

普洱茶经粉碎，筛分，烘干，无水乙醚脱脂，备用。精密称取一定量的普洱茶脱脂样品于150mL浸提瓶中，加入一定体积的热水在100℃条件下浸提，每隔20min振摇10s，浸提2h，过滤，滤液浓缩，冻干，取冻干粉配制成系列梯度质量浓度的溶液，再经色差计测定与蒸馏水的E值，计算出与色素质量浓度呈线性正相关的E值范围。样品浸提所得滤液定容至250mL，测定与蒸馏水的E值大小评价色素提取的高低。

1.3.3 普洱茶茶色素的提取

精密称取普洱茶脱脂样品1.250g于150mL浸提瓶中，加入一定体积的热水在相应温度下浸提，每隔2 0 min振摇1 0 s，浸提完毕后，过滤，滤液定容至250mL，再经色差计测定与蒸馏水的E值。试验分别考察了温度、液料比和提取时间对E值的影响，并在单因素试验的基础上，选取温度、液料比和提取时间3个因素的合适水平进行Box-Behnken中心组合设计，采用响应面分析法对提取工艺进行优化。

1.3.4 普洱茶茶色素清除DPPH自由基能力

按照优化的提取工艺浸提普洱茶茶色素，过滤，滤液旋转真空浓缩至一定体积，冷冻干燥，取冻干粉用蒸馏水配制成不同质量浓度的样品液。参照文献[16]，分别取2mL样品液于试管中，加入2mL 2×10-4mol/L DPPH自由基溶液(无水乙醇配制)，混合均匀，反应30min后在波长518nm处测定其吸光度A1，以2mL水代替样品测定吸光度为A0；以2mL样品与2mL无水乙醇混合液为A2，以消除样品本身的影响，以2mL水与2mL无水乙醇的混合液调零点。按下式计算清除率：

2 结果与分析

2.1 普洱茶中TFs、TRs和TBs的含量

普洱茶中茶色素TFs、TRs和TBs含量(占干物质的质量分数)分别为0.298%、2.19%、12.02%。普洱茶中茶色素以TBs含量最高，远远高于TRs和TFs，而TFs的含量很低。TFs、TRs和TBs都是茶多酚的不同程度的氧化产物，三者含量的高低与普洱茶独特的后发酵过程密切相关，即在整个“后发酵”过程中多酚类物质经过酶促氧化和弱非酶促氧化聚合后，先产生茶黄素类、茶红素类，再进一步氧化聚合生成茶褐素类物质，而茶褐素则大幅度增加，是形成普洱茶色泽的主要原因。

2.2 普洱茶茶色素的E值与质量浓度的关系

配制质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL的色素溶液，用色差计测定与蒸馏水的E值依次为21.98、36.07、50.32、67.30和82.14。以色素质量浓度(mg/mL)为横坐标X、以E值为纵坐标Y进行线性回归，方程为Y=30.31X+6.097，相关系数R2=0.9989，色素在0.5～2.5mg/mL范围内与E值在21.98～82.14之间呈良好的线性关系，如图1所示。因此，用色差计测定色素溶液的E值在21.98～82.14范围内的数据能够正确评价色素含量的高低。

图1 E值与茶色素质量浓度的相关图Fig.1 Relationship between color differenceEvalue and Pu-erh tea pigment concentration

2.3 单因素试验

2.3.1 提取温度对普洱茶茶色素提取E值的影响

固定茶色素提取的液料比35:1、时间1h，以提取温度对茶色素提取E值做单因素试验。设计提取温度60、70、80、90、10 0℃，结果见图2。

图2 提取温度对普洱茶茶色素提取E值的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

由图2可知，随着温度在60～100℃之间的升高，普洱茶茶色素提取E值增加显著，其原因可能与温度越高，茶色素扩散到溶剂中的速度越快及普洱茶中本身含有的简单多酚氧化转化为聚合多酚形式的茶色素越多有关。从实际生产情况考虑，提取温度不宜超过100℃。

2.3.2 液料比对普洱茶茶色素提取E值的影响

固定茶色素提取的温度80℃、时间1h，以液料比对茶色素提取E值做单因素试验。设计液料比15:1、25:1、35:1、45:1、55:1(mL/g)，结果见图3。

图3 不同液料比对普洱茶茶色素提取E值的影响Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

由图3可知，液料比的增大对提高普洱茶茶色素提取E值的效果较为明显，在15:1～45:1之间，E值呈直线上升趋势，而在45:1～55:1之间茶色素提取E值变化平缓且略有下降。这可能是由于普洱茶需要吸收较多水分，才能充分溶胀，有利于色素的溶出；当液料比达到45:1时，色素充分溶出，但继续增加溶剂比例后，其他成分过多溶出反而不利于色素的提取。考虑到降低后续工序浓缩的能耗及提高效率，液料比应控制在45:1以内。

2.3.3 提取时间对普洱茶色素提取E值的影响

固定茶色素提取的液料比35:1、温度80℃，以提取时间对茶色素提取E值做单因素试验。设计提取时间30、60、90、120、150min，结果见图4。

图4 提取时间对普洱茶茶色素提取E值的影响Fig.4 Effect of extraction time on color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

由图4可知，提取时间的延长对提高普洱茶色素提取E值的效果有一定的影响，在30～120min之间，E值呈上升趋势，而在120～150min之间E值趋于平缓。因此，提取时间宜控制在90～150min内。

2.4 采用响应面法优化普洱茶茶色素的提取工艺

根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验基础上，选取液料比、温度、时间3个因素的合适水平，对提取工艺进行响应面分析，其具体试验方案及结果见表1、2。

表1 普洱茶茶色素的提取响应面试验因素与水平表Table 1 Factors and levels in response surface design for optimizing the extraction of Pu-erh tea pigment

表2 普洱茶茶色素的提取响应面分析方案及其计算分析结果Table 2 Scheme and results of response surface design for optimizing the extraction of Pu-erh tea pigment

运用Minitab 14数据统计分析软件，使用未编码单位对试验数据进行多元回归拟合，回归模型系数及显著性检验结果见表3，得到液料比、温度、时间的二次多项回归模型。

表3 回归模型系数及显著性检验结果Table 3 Regression coefficients and significance test for the constructed quadratic polynomial model equation

由表3可以看出，根据P值判断(P＜0.05时水平显著)，各因素中一次项X2和二次项X22是最为显著的，其次是交互项X1X3，由此可见，各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

表4 回归方程方差分析表Table 4 Analysis of variance for the regression equation

表4回归方程方差分析表明，方程二次项影响是最为显著的，一次项影响也是极为显著的，交互项影响相对不显著，说明响应值的变化相对复杂。R2=0.9942较大，说明二次多项式回归效果比较好，失拟项为0.349不显著，说明回归方程拟合程度良好。

图5 提取E值残差分析图Fig.5 Residual plot for color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

对响应数据(E值)进行残差分析，残差值分析结果见图5，表明模型(1)能在很大程度上解释观测数据(E值)中的变异。

模型(1)的响应曲面及其等高线见图6，3组图直观地反映了各因素对响应值的影响。由图6可以看出温度对色素提取E值的影响最为明显，以液料比与时间的交互作用较大，但未达到显著水平。从图6也可以看出，当一个因素的水平固定为1时，能够预测另两个因素取不同水平组合的E值大小。因此，色素提取可以依据模型(1)的响应曲面及其等高线图，在实际生产中从能耗、效率及经济效益等多方面综合考虑来合理选择3因素的水平组合。

图6 各两因素交互作用的响应曲面和等值线图Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction temperature, extraction time and liquidto-material ratio on color differenceEvalue of Pu-erh tea pigment

单纯从色素提取的E值大小考虑，用Mintab 14软件进行分析，则可以求得最适的提取条件为X1=45:1、X2=100℃、X3=150min，预测色素提取的E值为52.29，在此条件下进行验证实验，重复3次，取平均值，提取液中E值为52.97，相对标准偏差为1.37%，与预测值相差1.3%，高出单因素试验和Box-Behnken组合中的最高E值4.73%。因此，基于响应曲面法所得的优化工艺参数准确可靠。

2.5 普洱茶茶色素清除DPPH自由基能力

DPPH自由基在国内外广泛用于清除自由基物质性质的研究与天然抗氧化剂的筛选。若受试物能将其清除，则表明受试物具有降低羟基自由基、烷基自由基或过氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链的作用[17]。普洱茶茶色素对DPPH自由基的清除结果见图9，可知样品质量浓度在10～60μg/mL范围内对DPPH自由基的清除率呈线性正相关，普洱茶茶色素清除DPPH自由基的IC50值为30.83μg/mL。普洱茶茶色素清除DPPH自由基的能力可能与其结构中的一些活性酚羟基和苯骈卓酚酮结构有关。

图7 普洱茶茶色素对DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging rates of Pu-erh tea pigment at various concentrations on DPPH free radicals

3 结 论

3.1 以与蒸馏水的E值作为色素提取的评价指标，基于试验设计软件Minitab 14，通过二次回归设计得到了普洱茶茶色素提取E与料液比、提取温度、提取时间的回归模型，利用响应优化器得到色素提取E值的优化工艺参数为液料比45:1(mL/g)、提取温度100℃、提取时间150min，色素提取E值52.97，相对标准偏差为1.37%，与预测值相差1.3%，高出单因素试验和Box-Behnken组合中的最高E值4.73%。因此，利用响应面分析方法对普洱茶茶色素提取工艺进行优化，可获得最优的工艺参数，能有效减少工艺操作的盲目性，从而为进一步的实验研究提供参考。

3.2 按照普洱茶茶色素提取的优化工艺提取得到的干燥产品清除DPPH自由基的体外抗氧化性实验，可知普洱茶茶色素具有良好的抗氧化作用，清除DPPH自由基的IC50为30.83μg/mL，普洱茶茶色素可以作为一种天然的抗氧化剂。

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Optimization of Process Conditions for Pu-erh Tea Pigment Extraction by Response Surface Analysis and Its Antioxidant Activity

YANG Xin-he1,2，LI Qin1,3，HUANG Jian-an1,3，LU Ying1,3，SHEN Zhi1，LIU Zhong-hua1,3,*
(1. National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Botanical Functional Ingedients, Changsha 410128,China；2. College of Life Science and Technology, Xiaogan University, Xiaogan 432000, China；3. Key Laboratory of Tea Science, Ministry of Education, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Objective: To optimize the extraction process for Pu-erh tea pigment and explore its antioxidant activity. Methods:Following single factor investigations, optimization of process conditions for the extraction of Pu-erh tea pigment based on the color difference valueEbetween distilled water and Pu-erh tea pigment was carried out using central design composite design combined with response surface methodology (RSM). 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay was used to evaluate the antioxidant activity of the pigment. Results: The optimal extraction conditions for Pu-erh tea pigment were liquid-to-material ratio of 45:1 (mL/g), extraction temperature of 100 ℃ and extraction time of 150 min. Under the optimal extraction conditions, a color differenceEvalue of 52.97 was obtained, which revealed 4.73% increase as compared to the highest color difference in single-factor investigations and Box-Behnken composite experiments. The IC50 value for the scavenging capability of Pu-erh tea pigment on DPPH free radicals was 30.83 μg/mL. Conclusion: It is feasible to optimize the extraction of Pu-erh tea pigment by response surface methodology. The Pu-erh tea pigment with excellent antioxidant activity has the potential to be further developed and utilized as a natural antioxidant.

Pu-erh tea；tea pigment；extraction；response surface methodology；antioxidant activity

S571.1

A

1002-6630(2011)06-0001-06

2010-04-21

“十一五”国家科技支撑计划重大项目(2007BAD58B00-03)；云南省政府茶叶专项(2007YNCXB-01-01)

杨新河(1974—)，男，讲师，博士，研究方向为天然产物化学。E-mail：yangxinhe@163.com

*通信作者：刘仲华(1965—)，男，教授，硕士，研究方向为天然产物化学。E-mail：Larkin-liu@163.com