响应面法优化越橘花色苷微波辅助提取工艺参数

吕春茂，王新现，董文轩*，孟宪军，王 博

(1.沈阳农业大学园艺学院，辽宁 沈阳 110866；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

响应面法优化越橘花色苷微波辅助提取工艺参数

吕春茂1,2，王新现2，董文轩1,*，孟宪军2，王 博2

(1.沈阳农业大学园艺学院，辽宁 沈阳 110866；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

为优化越橘花色苷提取工艺，运用微波辅助提取法，以含盐酸1%的乙醇溶液为提取剂，通过单因素试验对微波功率、时间、溶剂体积分数和温度等工艺条件进行研究，并通过提取工艺的响应面法，得出越橘果实花色苷的提取回归方程。结果表明，越橘果实花色苷的最佳提取工艺条件为微波功率500W、提取时间7min、乙醇体积分数55%、温度51℃。最优工艺条件下提取量为(1.47±0.15)mg/g。

越橘；花色苷；提取工艺；响应面法

越橘(bilberry)，又称蓝浆果或蓝莓果，属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vacciniumspp.)植物，全世界广泛分布，分布于我国的越橘属植物已有91种[1]。越橘果实营养丰富，其中富含的花色苷更是具有多种保健和营养功能[2-3]。近年来越橘的消费市场逐年扩大，被称为继苹果和柑橘之后的“世界第三代水果”[4]。

近年来国内外在植物花色苷提取方面已做了大量研究，已知的植物花色苷提取方法有热水提取法、醇提法、碱性水或碱性稀醇提取法、有机溶剂萃取法、超声法等[5-7]，但应用响应面法优化越橘花色苷微波辅助提取方面还鲜见报道。响应面分析法(re sp on se surfac e methodology，RSM)是一种优化工艺条件的有效方法，可用于确定各因素及其交互作用在工艺过程中对指标(响应值)的影响，精确地表述因素和响应值之间的关系[8-9]。本研究应用微波辅助提取法，选取功率、时间、温度、乙醇体积分数等因素，利用响应面法优化越橘花色苷的最佳提取工艺参数，以期为越橘花色苷的研究开发提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

野生越橘，2009年6月采于长白山，冰袋冷藏运输，实验室冷冻储藏。

丙酮、乙醇、甲醇、盐酸、冰乙酸、氯化钾、无水醋酸钠(均为分析纯)。

FD-IC-80真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；SHZ-Ⅲ循环水真空抽滤装置 上海华琦科学仪器有限公司；MAS-Ⅰ型常压微波辅助合成/萃取反应仪 上海新仪微波化学科技有限公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；FW80-1高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有公司；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料处理

将新鲜的越橘冻果打浆，在冰箱中预冷冻，放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，干燥品用万能粉碎机进行破碎，破碎粉放入冰箱冷藏室备用。

1.2.2 工艺流程

越橘果实冷冻干燥粉→微波辅助提取→真空抽滤→减压浓缩→真空干燥→花色苷粗品→花色苷粗品溶解定容→花色苷特定吸收波长处测定吸光度

1.2.3 单因素试验

在提取溶剂一定，其他条件一致的前提下，运用微波辅助提取法分别研究微波功率、提取温度、提取时间、乙醇体积分数对越橘花色苷色素提取效果的影响。

1.2.4 响应面分析优化提取参数的研究

为综合考虑各因素对越橘花色苷色素提取量的影响，在单因素试验基础上，根据Box-behnken的中心组合设计原理，以与色素提取量呈正比的花色苷吸光度差值(A)为优化指标，对影响显著的提取温度、时间、料液比、乙醇体积分数4个因素进行优化设计(表1)，设计了四因素三水平共计29组试验(中心点重复5次，用于估计实验误差)，试验设计方案和结果见表1。

表1 响应面设计因素水平及编码Table 1 Coded factors and their coded levels in response surface design

1.2.5 提取物的评价方法

采用差异pH法[10-12]测定提取液中色素含量。

A=(Aλmax－A700)pH1.0－(Aλmax－A700)pH4.5

A为待测溶液中花色苷吸光度；Aλmax为待测溶液在最大吸收波长的吸光度；A700为待测溶液在700nm时的吸光度；pH1.0为待测溶液在pHl.0条件下测定；pH4.5为待测溶液在pH4.5条件下测定。

根据文献[13-15]，越橘果实中花色苷含量计算公式如下：

式中：X为越橘果实花色苷含量/(mg/g)；A为吸光度；V为定容体积/L；F为稀释倍数；M为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；ε为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26900；m为样品干质量/g。

2 结果与分析

2.1 越橘花色苷最大吸收波长

花色苷粗品0.3g溶于60%乙醇并定容，取1mL用pH1.0的缓冲溶液定容至25mL，全波长扫描越橘果实花色苷缓冲液，得出曲线，如图1所示。

图1 越橘果实花色苷缓冲液全波长扫描图Fig.1 Scanning spectrum of bilberry anthocyanins

由图1可以看出，越橘果实花色苷粗提液在紫外区270～280nm和可见区510～530nm之间有吸收峰的出现，属于花色苷及其衍生物特征吸收峰的范围[16]。

2.2 单因素试验

2.2.1 溶剂种类对越橘果实花色苷提取量的影响

在微波功率500W、温度50℃、提取时间7min、料液比1:200的条件下，运用微波辅助提取法，考察了不同溶剂蒸馏水、丙酮、甲醇、乙醇越橘果实花色苷的吸光度值的变化，结果见图3，甲醇对越橘的花色苷吸光度值最大，乙醇略低，丙酮、蒸馏水次之。但因为甲醇与乙醇对花色苷提取效果的影响相差不大，且乙醇无毒、原料便宜，故选择乙醇做提取溶剂。

图2 溶剂对越橘果实花色苷提取量的影响Fig.2 Effects of different solvents on extraction efficiency of anthocyanins

2.2.2 盐酸乙醇溶液体积分数对越橘果实花色苷提取量的影响

在微波功率500W、温度50℃、提取时间7min、料液比1:200的条件下，运用微波辅助提取法，考察不同体积分数的盐酸乙醇溶液花色苷提取剂越橘果实花色苷的吸光度的变化，结果如图3所示。

图3 盐酸乙醇溶液体积分数对越橘果实花色苷提取量的影响Fig.3 Effect of HCl concentration on extraction efficiency of anthocyanins

由图3可知，含1% HCl的乙醇提取液越橘花色苷的吸光度最大。这说明采用盐酸-乙醇溶液进行越橘花色苷提取过程中，低体积分数的盐酸-乙醇溶液有利于花色苷提取，高体积分数则可能破坏花色苷结构[17]，从而导致提取量下降。

2.2.3 乙醇体积分数对越橘果实花色苷提取量的影响

在微波功率500W、温度50℃、提取时间7min、料液比1:200的条件下，运用微波辅助提取法，考察含1% HCl的不同体积分数的乙醇溶液微波辅助提取越橘果实中的花色苷吸光度的变化，结果如图4所示。

图4 乙醇体积分数对越橘果实花色苷提取量的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of anthocyanins

由图4可知，随着乙醇体积分数的增大，花色苷吸光度先是稳步上升而后缓慢递减，其中含1% HCl的60%乙醇溶液对花色苷的提取效果最好。

2.2.4 微波功率对越橘花色苷提取量的影响

以含1% HCl的60%乙醇溶液为提取溶剂，在温度50℃、提取时间7min、料液比1:200的条件下，选用不同功率微波辅助提取越橘果实中的花色苷，结果如图5所示。

图5 微波功率对越橘果实花色苷提取量的影响Fig.5 Effect of microwave power on extraction efficiency of anthocyanins

由图5可知，微波辅助提取时，当微波功率上升时，花色苷吸光度先缓慢提高，当功率达到500W时，花色苷吸光度达到最高，随后降低。这可能是因为当微波功率太高时造成温度太高，导致花色苷分解。

2.2.5 温度对越橘花色苷提取量的影响

以含1% HCl的60%乙醇溶液为提取溶剂，在微波功率500W、提取时间7min、料液比1:200的条件下，考察不同温度对越橘果实花色苷吸光度的影响，结果如图6所示。

图6 温度对越橘果实花色苷提取量的影响Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction efficienc of anthocyanins

温度对花色苷提取效果影响很大，本实验提取温度为50℃花色苷吸光度最大。适当的温度可以辅助提取溶剂和越橘果实冻干粉融合，加速越橘果实内花色苷的溶出。但温度过高会使花色苷分解，使花色苷提取率下降。

2.2.6 时间对越橘花色苷提取量的影响

以含1% HCl的60%乙醇溶液为提取溶剂，在微波功率500W、提取温度50℃、料液比1:200的条件下，不同微波辅助提取时间对越橘果实花色苷提取量的影响，如图7所示。

图7 提取时间对越橘果实花色苷提取量的影响Fig.7 Effect of extraction time on extraction efficiency of anthocyanins

越橘果实花色苷吸光度随微波时间的延长缓慢增长，当提取时间到达7min时，吸光度达到最大，随后下降。因为在50℃条件下，随着时间的延长，也会有部分花色苷分解，相应样品的吸光度就会略有下降。

2.3 响应面分析

2.3.1 响应面分析优化试验设计及方差分析

表2 响应面分析方案与试验结果Table 2 Protocol and experimental results of response surface design

根据Box-behnken的中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，选取微波功率、提取时间、微波温度、乙醇体积分数进行四因素三水平的响应面分析试验，试验设计与试验结果见表2。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

由表3数据处理结果可知，P值小于0.05时，表明此模型显著，且此模型中一次项A、C和二次项均为显著项。并且该模型的R2=98.32，说明此模型与实验实际拟合较好，实验失拟性小，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。回归系数显著性检验表明，在所各取的因素水平范围内，对越橘果实花色苷提取率影响排序为温度＞功率＞时间＞乙醇体积分数。2.3.2 拟合模型的建立

通过中心组合试验获得的试验数据，运用DX 7-Trial软件对试验数据结果进行整理分析，确立如下回归预测模型：

Y=0.17460＋2.41667×10-3A＋7.50000×10-4B＋2.50000×10-3C－1.66667×10-4D－7.50000×10-4AB＋2.50000×10-4AC－2.50000×10-4AD＋2.50000×10-4BC＋2.50000BD＋4.33681×10-19CD－0.018800A2－5.30000×10-3B2－0.010175C2－2.67500×10-3D2

2.3.3 响应面分析

从图8可以看出，温度对越橘花色苷的提取影响最大，功率次之，提取时间和乙醇体积分数对越橘果实花色苷提取量影响不显著。通过软件分析，得到越橘果实花色苷的最佳提取条件为温度51.24℃、微波功率506.7W、提取时间7.06min、乙醇体积分数55.4%。在此条件下花色苷提取量预测值为1.47mg/g(吸光度预测为0.1755)。

实际操作中将响应面分析法优化的提取工艺条件适当调整为温度51℃、微波功率500W、提取时间7min、乙醇体积分数55%，在此条件下对越橘果实花色苷进行3次提取实验，花色苷提取量为(1.47±0.15)mg/g，响应面的实验值与回归方程预测值吻合良好。

图8 各两因素交互作用对花色苷提取量的影响Fig.8 Response surface plots showing the pairwise interactive effects of four factors on extraction efficiency of anthocyanins

3 结 论

根据单因素试验结果可知，微波辅助提取越橘果实花色苷时，用体积分数为1%的盐酸化乙醇、微波功率500W、时间7min、温度50℃、乙醇体积分数60%时，越橘果实花色苷的提取量达到最大值。

微波辅助提取越橘果实冻干粉花色苷过程中，各因素对越橘花色苷提取量影响从大到小依次为温度、微波功率、时间、乙醇体积分数。

应用响应面分析法优化提取工艺条件，经实验验证结果为温度51℃、微波功率500W、提取时间7min、乙醇体积分数55%，在此条件下越橘果实花色苷提取量为(1.47±0.15)mg/g。

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Optimization of Microwave-assisted Extraction Process for Anthocyanins from Bilberry by Response Surface Methodology

In order to optimize the microwave-assisted extraction process for anthocyanins from bilberry using 1% HCl ethanol as the solvent, response surface methodology was used to explore the effects of microwave power, microwave treatment time,solvent concentration and extraction temperature on extraction rate of anthocyanins on the basis of single-factor investigations.Results indicated that the optimal extraction conditions for anthocyanins from bilberry was microwave powder of 500 W,microwave treatment time of 7 min, solvent concentration of 55%, and extraction temperature of 51 ℃. Under the optimal extraction conditions, their extraction efficienc of anthocyanins from bilberry was (1.47 ± 0.15) mg/g.

bilberry；anthocyanins；extraction processing；response surface methodology (RSM)

TS255.1

A

1002-6630(2011)06-0071-05

2010-05-19

沈阳市青年人才基金计划项目(1081240-1-02)；沈阳农业大学博士后基金项目

吕春茂(1970—)，男，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：bt_lcm@126.com

*通信作者：董文轩(1963—)，男，教授，博士，研究方向为果树种质资源。E-mail：wxdong63@126.com