VEGF蛋白及mRNA在乳腺癌组织中的表达及意义

朱德为，刘庚勋，李正贤

（1.解放军169医院病理科，湖南 衡阳 421002；2.湖南省师范大学第二附属医院，解放军163医院病理科，湖南 长沙 410003）

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，癌细胞的生长、浸润及转移均离不开新生血管及淋巴管的生成。VEGF是最重要的血管内皮刺激因子，肿瘤血管生成过程中发挥核作用[1]。本研究应用免疫组化En-visionTM和半定量RT-PCR法，检测乳腺癌和乳腺纤维腺瘤中VEGF蛋白及mRNAVEGF的表达情况，并分析其临床病理参数间的关系，旨在探讨VEGF蛋白和mRNA在乳腺癌侵袭和转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

所有病例均为我院2007年6月～2009年6月间临床资料完整的乳腺癌(均为浸润性癌)病例56例 ，年龄37～72岁,中位年龄为45.3岁,所有患者均接受手术治疗，术前未接受过放疗、化疗或免疫治疗，经病理确诊。组织学分级：I级15例，II级28例，III级13例。有淋巴结转移者35例,无淋巴结转移者21例；同时随机抽取同时期确诊的乳腺纤维腺瘤30例作对照组。标本分两份，一份经4%中性福尔马林固定,石蜡包埋,连续3 μm切片,常规HE染色及VEGF免疫标记。另一份迅速投入液氮中速冻,然后置于-70℃的冰箱保存备用。

1.2 免疫组化染色

即用型VEGF单克隆抗体、EnvisonTM试剂盒及DAB显色剂均购于福州迈新公司,染色步骤按试剂盒说明进行操作。以已知的试剂盒提供的VEGF阳性切片做阳性对照，以PBS液代替一抗作空白对照和用非免疫血清代替一抗的阴性对照。

1.3 阳性结果评定

VEGF以细胞膜或胞质出现明显的黄色或棕黄色颗粒视为阳性细胞。在奥林帕斯光学显微镜下观察阳性细胞比例和阳性着色深浅。对免疫组化染色结果进行半定量分析,按照细胞着色的深浅分成:阳性细胞数<10%为(-),阳性细胞数10%～25%为(+)，25%～50%(++),多于 50%为(+++)。

1.4 乳腺癌中mRNAVEGF的表达

将保存于-70℃冰箱的肿瘤组织在无酶操作下，按Trizol(Invitrogen公司)试剂盒说明抽提组织总RNA后测吸光度值,计算RNA的纯度，然后吸取相同剂量的RNA(2～4 μg),按照MBI公司逆转录试剂盒具体操作，按说明合成cDNA。合成的cDNA经PCR扩增，VEGF引物设计参照文献[2]合成，上游引物序列为:5'-GAGGGCAGAATCATCACGAAGT-3',下游序列为:5'-TCCTATGTGCTGGCCTTGGTGA-3',内对照GAPDH(三磷酸甘油醛脱氢酶)的引物采用Primer5.0设计，GAPDH上游引物序列为5'-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3',下游引物序列为5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3',扩增片段分别为258bp和540bp,由上海生物工程技术有限公司合成。PCR反应条件:95℃预变性33min,94℃ 40s,58℃ 40 s,72℃ 40 s，35 个循环，72℃延伸 5 min。PCR扩增后取5 μL扩增产物,进行1.2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行凝胶电泳分析。紫外灯下观察结果、拍照,在电脑凝胶成像系统中分析电泳带的灰度，用VEGF/GAPDH的比值表示VEGF的相对表达水平。

1.5 统计学处理

应用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析，采用χ2检验，非参数Spearman等级相关检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 乳腺癌组织及乳腺纤维腺瘤组织中VEGF蛋白的表达

免疫组化方法检测乳腺癌组织中VEGF蛋白的阳性率为75.0%，阳性染色定位于癌细胞胞浆(见图1，图2)。VEGF的表达率与淋巴结转移和组织学分级成正相关，在淋巴结转移组中阳性表达率明显高于无淋巴结转移组(P<0.05)；肿瘤组织学分级越高者其阳性表达率也增高，组间比较亦有显著性差异(P<0.05)。见表1。

图1 VEGF在乳腺纤维腺瘤中阴性表达(EnvisionTM×200)

图2 VEGF在乳腺癌中阳性表达(EnvisionTM×400)

表1 乳腺癌组织中VEGF表达与临床病理联系

2.2 乳腺癌组织及乳腺纤维腺瘤组织中mRNA VEGF的表达

图3 乳腺癌组织中mRNAVEGF的表达

半定量RT-PCR方法检测乳腺癌组织中mRNAVEGF的表达 (见图3)，结果发现所有病例均有mRNAVEGF表达,正常乳腺纤维腺瘤组织mRNAVEGF相对表达量为(0.3275±0.0384)；乳腺癌组织mRNAVEGF 相对表达量为(0.8207±0.1042)，明显高于对照组 (P＜0.05)，在VEGF蛋白表达高的病例中,mRNAVEGF表达也较高。与肿瘤的组织学分级和淋巴结转移呈正相关。

3 讨论

肿瘤的生长与转移是一个多基因参与多步骤的复杂过程，血管形成在肿瘤的生长、浸润和转移过程中发挥极其重要的作用。众多的血管形成相关因子中，VEGF被认为可能是最强烈的促强烈的血管生成因子[2]，VEGF是内皮细胞的特异性的有丝分裂原，可特异性地促进内皮细胞生长及血管生成，并能提高血管通透性，刺激血管和淋巴管的生成，促进内皮细胞的增生与迁移，增加血管和淋巴管通透性，促进某些蛋白质水解酶的作用导致基质水解，为血管内皮细胞的迁移和肿瘤细胞的转移提供基质[3]。VEGF与乳腺癌血管生成密切相关，并能促进其生长、浸润及转移[4]。

Adams等[1]在研究中发现VEGF表达量与乳腺癌的分期直接相关。本实验结果显示,在乳腺癌组织中阳性表达率显著高于乳腺纤维腺瘤组(P＜0.05);乳腺癌VEGF表达与淋巴转移、肿瘤组织学分级有相关性(P＜0.05)。说明VEGF蛋白的表达与淋巴结转移相关。同时发现VEGF阳性率在分化较差的乳腺癌中较高,其阳性率随组织学分级增高而增高。与Koyama，Berezov，施红旗等的研究结果一致[5-7]。本研究显示通过检测VEGF蛋白的表达,可以预测乳腺癌的恶性程度,为临床治疗提供重要参考。

本实验还采用半定量RT-PCR法检测mRNA VEGF的水平，结果显示其平均表达水平与乳腺癌淋巴结转移、肿瘤组织学分级显著相关;组织学分级越高mRNAVEGF的表达水平越高,并且淋巴结转移组高于无转移组(P＜0.05)，与章乐虹等[8]的研究结果一致。本研究结果表明,VEGF蛋白及mRNA在乳腺癌进展过程中起重要作用,与肿瘤的恶性生物学行为直接相关。

总之，VEGF蛋白和mRNAVEGF在乳腺癌中的表达率高，而在乳腺纤维腺瘤中表达率低下，且与乳腺癌的组织学分级、浸润和转移关系密切，VEGF有可能成为判断乳腺癌侵袭和转移的有价值指标和新的治疗靶点。

[1]Adams J,Carder PJ,Banks RE.Vascular endothelial growth factor(VEGF)in breast cancer:comparison of plasma,serum and tissue VEGF and microvessed density and effects of tamoxifen[J].Cancer Res,2000,60(11):2989-29994.

[2]朱学强,任刚,胡洪林.乳腺癌组织中 VEGF,C-erbB-2、P53及Ki-67的表达与临床意义[J].西部医学,2009,21(3):427-429.

[3]Li J,Zheng YP,Kirsner RS,Angiogenesis in wound repair:angiogenic growth factors and the extraccllular matrix[J].Microse Res Tech,2003,60(1):107-114.

[4]李慧玲,苏亚娟,邬剑,等.MMP-2,VEGF在卵巢癌组织中的表达及其临床意义[J].中国实验诊断学,2009,13(6):726-729.

[5]Koyama Y,Kaneko K,Akazawa K,et al.Vascular endothelial growth factor-C and vascular endothelial growth factor-D messenger RNA expression in breast cancer association with lymph node metastasis[J].Clin Breast Cancer,2003,4(5):354-360.

[6]施红旗,陈丽荣.HIF21α、VEGF在乳腺浸润性导管癌中的表达及临床意义[J].实用肿瘤杂志,2006,21(2):131-134.

[7]Berezov TT,Ovchinnikova LK,Kuznetsova OM,et al.Vascular endothelial growth factor in the serum of breast cancer patients[J].Bull Exp Biol Med,2009,148(3):419-424.

[8]章乐虹,杨基鹏,彭艳华,等.乳腺癌组织中survivin及其剪接体与VEGF的表达及临床意义[J/CD].中华普通外科学文献:电子版,2009,3(4):274-279.