莽山烙铁头蛇粗毒双向凝胶电泳分析

聂东宋,刘 宇,吴 喆,刘立超,朱政斌

(湖南理工学院 化学化工学院,湖南 岳阳 414006)

莽山烙铁头蛇粗毒双向凝胶电泳分析

聂东宋,刘 宇,吴 喆,刘立超,朱政斌

(湖南理工学院 化学化工学院,湖南 岳阳 414006)

采用固相 pH 梯度等电点聚焦-SDS 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳对莽山烙铁头粗毒进行了分析,通过银染法显色,电脑软件识别出约40个蛋白质点.其中分子量超过130 kD 的蛋白质点很少,分子量90 kD～10 kD 的区域均有蛋白质点分布,分子量34 kD区域的蛋白质点较为密集,且它们的含量明显较高.从蛋白质点的等电点分布范围分析,偏于碱性端的蛋白质明显多于酸性端的蛋白质,且分布在中性偏碱( pH 7～8)的区域.质谱数据的数据库搜寻结果表明:莽山烙铁头蛇毒中含有类凝血酶组分、纤溶酶组分、血小板聚集蛋白、抗血小板聚集蛋白和平滑肌钙离子通道阻断剂等组分.

莽山烙铁头蛇毒;二维电泳;蛋白质组

蛇毒的研究是天然动物毒素研究的一个重要领域,蛇毒是一个潜在的发现新的生物活性分子的重要资源[1].国内外的研究表明,无论在基础理论还是应用研究上,蛇毒作为新型生物医药的分子模板、神经生物学研究的工具试剂、新型生物杀虫剂的先导分子和蛋白质工程的框架分子等方面的研究均有不可替代的功能[2～4].

莽山烙铁头蛇是中国湖南莽山国家自然保护区特有大型剧毒蛇种,根据莽山国家自然保护区陈远辉的调查[5],莽山烙铁头蛇是我国濒临灭绝的物种,目前只在莽山国家自然保护区发现,并且数量只有大概300～500条,由于遭到非法捕猎,其数量日益减少.目前对莽山烙铁头蛇毒毒液的研究非常少,只对莽山烙铁头蛇毒素中的PLA2成分进行了部分研究[6～8].

传统的蛇毒素分离多采用柱层析法,该方法虽然有制备量大的优点,但难于使大多数组分同时得到分离,且很多含量很少的成分常被遗漏.蛋白质组学研究技术和其他微量分离分析技术的发展,正推动动物毒素的研究从单个毒素研究发展到毒素组研究,特别是双向凝胶电泳和多维色谱与现代质谱技术的结合,使得分析一个动物毒腺中的全部毒素分子成为可能[2～4].目前,用双向凝胶电泳技术对莽山烙铁头蛇毒毒素进行分离并进而进行鉴定的工作尚未见报导.本文报道采用固相pH 梯度-SDS 双向电泳技术对我国特有濒危物种莽山烙铁头蛇粗毒进行分析鉴定的实验结果.

1 材料和方法

1.1 试剂

固相 pH 梯度干胶条( pH3～10,L 13 cm)、载体两性电解质( pH3～10)、IPG 缓冲液( pH3～10)和覆盖液为Pharmacia 公司产品;二硫苏糖醇、碘乙酰胺为Sigma 公司产品;丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、Tris、CHAPS、SDS、甘氨酸为Amresco 公司产品;双向电泳标准蛋白与低分子量标准蛋白购自上海伯奥生物制品公司.

1.2 仪器设备

Multiphor Ⅱ电泳单元、 EPS 3500 电泳仪等电聚焦电泳系统( pharmacia 公司), Bio-Rad Protein Ⅱ垂直板电泳槽,Gel Do c2000 凝胶成像仪,PDQUEST 2D胶分析软件( Bio-Rad 公司).质谱仪为英国Micromasss公司的电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱 Micro Q-TOF,配备有毛细管液相色谱仪(CapLC)和钠升喷雾源.

1.3 生物材料

莽山烙铁头蛇粗毒由湖南省宜章县境内莽山自然保护区陈远辉提供,冷冻干燥后使用.

1.4 第一向固相pH 梯度等电聚焦电泳

基本按Bjellguist[9]的方法进行,取pH3～10L,13cm干胶条,揭去保护膜,置干胶条于水化槽中进行水化(水化液组成为:脲12.0 g ,CHAPS 0.5 %,pharmalyte 3-10 为0.13 ml,DTT 50 mg,加水定容至25 ml,并加入少量溴酚蓝),水化时间16～18 h.取出胶条放入Multphor Ⅱ电泳单元塑料平行沟槽板的沟槽中,安置好电极及样品杯,每个样品杯点样50～100μl,加入70～80 ml 石蜡油完全覆盖胶条,连接EPS3500电源,按以下三个程序进行电泳:(1)300Ⅴ,1 mA,4.5h;(2)2000 Ⅴ,3mA,5h;(3)2500Ⅴ,1mA,6.5h.电泳完毕,从槽中取出胶条,加入平衡液A 振荡平衡10 min,再换平衡液B 振荡平衡10 min,取出胶条,准备第二向电泳.

1.5 第二向SDS-PAGE 垂直平板电泳

按Bjellguist[9]的方法进行,采用分离胶浓度为15 %的不连续SDS-PAGE 垂直板电泳.将已平衡好的胶条置于第二向凝胶顶端,排除气泡,使二者紧密接触,用1%琼脂糖凝胶封固胶条,接通电源,并通15℃左右的循环冷却水冷却.20mA 恒流电泳,待溴酚蓝迁移至分离胶与浓缩胶的界面处,再将电流升至 40 mA恒流电泳,待溴酚蓝前沿距凝胶板底边1cm 处,即可停止电泳,准备剥胶和染色.

1.6 银染

取出凝胶板,置于固定液中,30min后,换敏化液敏化 30min,倒去敏化液,以双蒸水洗 3 次,每次5min,然后置于银染试剂中染色20min,再以双蒸水洗2 次,每次1min,加显影剂,至蛋白质点完全显现为止.倒去显影试剂,立即换终止液终止显色,10min 后以双蒸水洗涤3 次,每次5min,然后置于保存液中,30min 后,再换一次保存液保存,留待扫描及进行图像分析.

1.7 蛋白质的原位酶解

蛋白质的原位酶解参照陈平等[10]的方法稍作修改,主要过程如下:(1)脱色:银染的蛋白质点割下后置于EP管中,用双蒸水冲洗两次后加入新鲜制备的脱色工作液(30 mmol/L K3Fe(CN)6∶100 mmol/ L Na2S2O3= 1∶1)50μl,约1～2 min 后可见蛋白质点的棕色消失,此时马上用水冲洗停止反应.将溶液去除后把胶切成小块,并用200mmol/L 的NH4HCO3冲洗,用纯乙腈脱水至胶块变为白色后置于真空干燥泵中抽干.(2)还原和烷基化:在上述每管样品中加入50μl 100 mmol/ L NH4HCO3(含DTT 10 mmol/L),57 ℃保温1h后室温冷却,去掉过量液体,迅速加入同样体积的用100mmol/L NH4HCO3新鲜配制的55mmol/L碘乙酰胺,室温暗处放置30min ,反应完成后用100mmol/ L的NH4HCO3冲洗两次,再用乙腈脱水后加入等体积的100mmol/L NH4HCO3,冻干.(3)酶解:TPCK2胰蛋白酶用50mmol/ L 的NH4HCO3(含5mmol/L CaCl2)配成0.1g/ L 的溶液,每管抽干的胶块中加入约10μl 让其胶块吸收,胶块吸胀后将多余酶液吸去,再加入20μl不含酶的缓冲液覆盖,37 ℃过夜消化.(4)萃取:酶解后的肽用50μl 5 % TFA/ 50 % ACN 萃取两次,合并萃取液冻干后进行质谱分析.

1.8 Q-TOF MS分析

酶解产物鉴定用质谱仪为英国Micromasss公司的电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱Micro Q-TOF,配备有毛细管液相色谱仪(CapLC)和钠升喷雾源.样品进行 CapLC-ESI-MS/MS全自动分析,毛细管 HPLC装备一个C18脱盐预柱(5mm×320um),毛细管柱为C18(15cm×75um),样品由自动进样器进入预柱,由C泵以30ul/min的流速将样品脱盐3分钟后,经C18毛细管柱梯度洗脱进行肽段分离,梯度可根据样品情况设定,本次实验的梯度为60 min中乙晴浓度5 %-50 %,流速3 ul/min,柱前分流使进柱流速0.3ul/min,分离后的肽段直接进入ESI离子源,对于强度超过阈值的肽段自动进行MS/MS测定.所有MS测定均在正离子模式下进行.质谱仪的校正是用PPG-2000的串联碎片校正的,质量误差为±0.1Da.

1.9 质谱数据的数据库搜寻

质谱数据以pkl.的文件格式提交Mascot搜索(网站http:www.matrixscience.com),数据库选NCBInr,物种选 Human,最大允许的片段离子质量误差为 0.5Da,肽质量是单一同位素质量,胰蛋白酶消化,最多允许1个不完全裂解位点,半胱氨酸为脲甲基半胱氨酸(Carbamidomethyl-Cys).

2 结果与讨论

2.1 莽山烙铁头蛇粗毒的双向电泳图谱

图1为1mg 莽山烙铁头蛇粗毒干粉在固相pH梯度(3～10L)-SDS 双向电泳凝胶板上分离后经银染得到的图谱.采用PDQUEST 双向凝胶电泳分析软件可以识别40个左右的蛋白质点,我们曾先后对莽山烙铁头蛇粗毒通过离子交换层析与反相HPLC进行分离,可以得到近10个组份(结果未显示),上述2D 胶分析结果说明双向电泳的灵敏度远高于传统的柱层析与HPLC方法.从展现蛋白质点的分子量分布范围来看,分子量超过130kD的蛋白质点几乎未见,分子量90kD至10kD的区域均有蛋白质点分布,分子量34kD区域蛋白质点较为密集,且它们的含量明显较高.分子量10kD以下的蛋白质点没有大分子量的蛋白质点集中,可能是粗毒中含有一些分子量较分散的多胺类物质所致.从蛋白质点的等电点分布范围分析,偏于碱性端的蛋白质明显多于酸性端的蛋白质,尤其是分子量10kD以上的蛋白质点较多,且分布在中性偏碱( pH 7～8)的区域.

图1 莽山烙铁头粗毒的双向电泳图谱

2.2 质谱数据的数据库搜寻结果

电泳后的蛋白质进行回收并测得其肽指纹图,根据肽序列质谱数据,同时测得蛋白质质量和N端测序,根据分析所得的数据进行数据搜索,质谱数据以 pkl.的文件格式提交 Mascot搜索(http:www.matrixscience.com),最大允许的片段离子质量误差为 0.5Da,肽质量是单一同位素质量,胰蛋白酶消化,最多允许1个不完全裂解位点,半胱氨酸为脲甲基半胱氨酸(Carbamidomethyl-Cys),质谱数据的数据库搜寻结果表明:莽山烙铁头蛇毒中含有类凝血酶组分、纤溶酶组分、丝氨酸蛋白酶、血小板聚集蛋白、抗血小板聚集蛋白和平滑肌钙离子通道阻断剂等20个组分.这些组成大部分为其它蛇类包括竹叶青、烙铁头、眼镜蛇的同源蛋白等.具体搜索结果见表1.

表1 莽山烙铁头初毒质谱数据的数据库搜寻结果

由于莽山烙铁头的基因组和蛋白质序列数据资源目前尚未建立,加之物种间相同功能蛋白质的一级结构上的差异,上述鉴定结果有待进一步验证.相当多的蛋白质点虽获得肽质谱指纹数据,但在搜寻中未能找到与数据库中误差在0.5质子单位以内的已知蛋白质的肽质谱指纹,有可能这些蛋白质是莽山烙铁头毒液中特有的蛋白质.下一步我们将对这些蛋白进行进一步的分离纯化与鉴定.

[1]Geoff W.Birrell,Stephen T.H.Earl,Tristan P.Wallis,et al.The Diversity of Bioactive Proteins in Australian SnakeVenoms[J].Mol.Cell.Proteomics,Jun 2007,(6):973～986

[2]Solange M.T.Serrano,John D.Shannon,DeyuWang,et al.A multifaceted analysis of viperid snake venoms by two-dimensional gel electrophoresis:An approach to understanding venom proteomics[J].Proteomics 2005,5(2):501～10

[3]Bryan G.Fry.From genome to “venome”:Molecular origin and evolution of the snake venom proteome inferred from phylogenetic analysis of toxin sequences and related body proteins[J].Genome Research,2005,15(3):403～420

[4]Shuting LI,Jingqiang WANG,Xumin ZHANG,et al.Proteomic characterization of two snake venoms:Naja naja atra and Agkistrodon halys[J].Biochem.J.2004,(384):119～127

[5]陈远辉.莽山烙铁头蛇的资源调查报告[J].蛇志,2003,(01):62-64

[6]Murakami MT,Kuch U,Betzel C,Mebs D,Arni RK.Crystal structure of a novel myotoxic Arg49 phospholipase A2 homolog (zhaoermiatoxin)from Zhaoermia mangshanensis snake venom:insights into Arg49 coordination and the role of Lys122 in the polarization of the C-terminus[J].Toxicon.2008,51(5):723～35

[7]Murakami MT,Kuch U,Mebs D,Arni RK..Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of a novel Arg49 phospholipase A2 homologue from Zhaoermia mangshanensis venom[J].Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.2007 Jul 1,63(Pt 7):605-7

[8]Mebs D,Kuch U,Coronas FI,Batista CV,Gumprecht A,Possani LD.Biochemical and biological activities of the venom of the Chinese pitviper Zhaoermia mangshanensis,with the complete amino acid sequence and phylogenetic analysis of a novel Arg49 phospholipase A2 myotoxin[J].Toxicon.2006,47(7):797～811

[9]Bjell guist B,Pasquali C,Ravier F,Sanchez J C ,Hochs tr as ser DF.Micropreparative two-dimentional electrophores is allowing the separation of samples cont aining mil ligram amounts of proteins[J].E lec trop hor esis,1993,(14):1357～1365

[10]陈 平,谢锦云,梁宋平.双向凝胶电泳银染蛋白质点的肽质谱指纹图分析[J].生物化学与生物物理学报,2000,32 (4):387～391

Analysis of Two-Dimensional Electrophoresis of Toxin From the Ermia mangshanensis

NIE Dong-song,LIU Yu,WU Zhe,LIU Li-chao,ZHU Zheng-bin
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan Institute of Science and Technology,Yueyang 414006,China)

In this study,Crude venom of the Ermia mangshanensis snake was separated by two-dimensional gel electrophoresis ( 2D-PAGE)with the separation in the first dimension on a wide range immobilized pH ( 3- 10)gradient.The results showed that over 40 protein spots were presented on a silver stained 2D-gel.Molecular weight More than 130 kD were almost not detected.About 35 spots with relatively high concentration were located on the region among the molecular weight of 34 kD.The basic proteins are much more than the Acidic proteins within the range from pH 7～8.MS database search results showed that Ermia mangshanensis venom contained thrombin,plasmin components,platelet aggregation protein,anti-platelet aggregation protein,smooth muscle components of calcium channel blocking agents.

Ermia mangshanensis venom;two-dimensional electrophoresis;proteome

Q786

A

1672-5298(2011)01-0048-04

2010-12-03

湖南省教育厅科研项目(06C370);湖南省教育厅青年基金项目(07B029);湖南省高校科技创新团队支持计划资助项目

聂东宋(1967− ),男,湖南衡阳人,湖南理工学院化学化工学院副教授.主要研究方向:新基因的克隆与功能