酿酒酵母ADH2基因沉默表达载体的构建

林燕环，魏 芳，叶冰莹，张积森，陈由强

(福建师范大学生命科学学院/农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室，福建 福州 350108)

可再生生物能源能够替代不可再生能源，支持可持续发展的能源，具有重大现实意义。目前随着能源危机的加剧，在产业规模方面发展最快的是燃料乙醇[1]。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是乙醇发酵的主要菌种[2]。因此获得乙醇高产菌株是其发展方向。在酿酒酵母中与乙醇代谢相关的乙醇脱氢酶由ADH1－ADH5编码，其中ADH2催化乙醇氧化为乙醛，其他4个编码基因催化乙醛还原成乙醇[3－5]。在发酵培养过程中，当葡萄糖被消耗完后，ADH2开始催化利用乙醇作为碳源[6]。因此，破坏ADH2催化的乙醇分解代谢反应，提高酿酒酵母合成乙醇的能力是可行的。目前主要利用基因敲除技术敲除ADH2基因，一些研究表明ADH2基因敲除突变株遗传稳定性差[2]。本文利用重叠延伸PCR方法，构建了酿酒酵母ADH2基因沉默的表达载体，以期获得高产的乙醇突变株并能克服遗传稳定差的缺点。

1 材料与方法

1.1 菌种及质粒载体

工业酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和大肠杆菌DH5α由福建师范大学生命科学学院农业部甘蔗生理遗传开放重点实验室提供。pUG6和表达载体pYES2.0由福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心惠赠。

1.2 酶和主要试剂

高保真酶、rTaq酶、T4DNA连接酶、KpnⅠ和NotⅠ均购于Takara公司。凝胶纯化试剂盒购自Promega公司。PCR引物由上海生工公司合成。DNA测序由TAKARA公司完成。

1.3 引物设计

根据重叠延伸PCR的原理设计引物[7]，合成以下2对引物。(1)P1:5'-CGGGGTACCAGCTACAAAAAGCATACAATCAACT-3'，P2:5'-GCGTACGAAGCTTCAGCTGGCCCTTAACGTTTTCACCCATGCCG-3';(2)F1:5'-CAGCTGAAGCTTCGTACGC-3'，F2:5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCATAGGCCACTAGTGGATCTG-3'。

其中P1引物为5'UTR序列前25个碱基，且在5'端引入KpnⅠ的酶切位点;P2引物中5'端前19个碱基与Kanr基因序列前19个碱基互补;F1引物为Kanr基因序列前19个碱基;F2引物与Kanr基因序列3'端23个碱基互补，并在5'端引入NotⅠ酶切位点及保护碱基。

1.4 重叠延伸PCR扩增沉默组件

该沉默组建需要3个PCR反应来完成。首先以酿酒酵母Y01基因组为模板，P1、P2为上下游引物，进行PCR扩增ADH2基因的5'UTR(PCR1)，同时以质粒PUG6为模板，F1、F2为上下游引物，进行PCR扩增KanMX(PCR2)。PCR1、PCR2的反应用高保真酶，按标准方法以50 μL体系进行扩增，将 PCR1、PCR2的产物按照胶回收试剂盒推荐方法进行纯化回收。然后取PCR1的纯化产物1 μL，PCR2的纯化产物0.4 μL为模板，以P1、F2为上下游引物，进行第3个PCR(PCR3)。通过第3个PCR，用外侧引物将 片段5'UTR和KanMX完成拼接。具体的扩增程序参照表1。

表1 PCR反应条件Table1 PCR reaction conditions

1.5 重组表达质粒的构建

通过KpnⅠ、NotⅠ分别将空表达载体pYES2.0和插入片段双酶切，连接获得表达质粒，构建图1。

图1 酿酒酵母表达载体pSADH2构建示意图Fig.1 Construction of the silencing expression vector

1.6 ADH2基因沉默表达载体pSADH2的构建与鉴定

将上述PCR3扩增得到的重叠延伸PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将鉴定为正确的片段胶回收纯化后，用KpnⅠ和NotⅠ双酶切，回收约1942 bp的片段，与经KpnⅠ和NotⅠ双酶切纯化的表达载体pYES2.0过夜连接;将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布含氨苄青霉素的LB平板。挑取白色菌落，37℃ 200 r·min－1摇菌过夜，提取质粒，进一步用酶切和测序鉴定。阳性重组质粒命名为pSADH2。

2 结果

2.1 PCR

分别用引物P1、P2和F1、F2进行PCR扩增获得ADH2基因的5'UTR基因和KanMX基因。然后，以这2个片段为模板，以P1、F2为引物重叠延伸PCR获得融合片段。电泳结果(图2)表明，PCR扩增出5'UTR基因、KanMX基因及其融合片段与预期的理论值大小相符，可用于后续的研究。

2.2 ADH2基因沉默表达载体pSADH2的鉴定

新构建的沉默表达载体pSADH2共7797 bp，以pYES2.0为载体，带有沉默ADH2基因以及G418的抗生素标记基因，可以用G418来筛选培养转化菌株。

提取构建的沉默表达载体pSADH2质粒DNA，根据其多克隆位点进行酶切鉴定，用限制性内切酶KpnⅠ和NotⅠ分别对其单酶切和双酶切，酶切产物电泳结果见图3。

图2 PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoresis pattern of PCR product

图3 pSADH2质粒DNA酶切产物电泳图Fig.3 Electrophoresis pattern of the plasmid pSADH2 digested by restriction digestion

2.3 ADH2基因沉默表达载体pSADH2的序列测序鉴定

提取构建的沉默表达载体pSADH2质粒DNA测序结果(图4)与pUG6上KanMX基因与ADH2的5'UTR序列完全相符。通过以上结果分析，构建的ADH2沉默表达载体pSADH2结构正确，可用于后续的转化试验。

3 讨论

本研究采用重叠延伸PCR成功构建了酿酒酵母ADH2基因沉默表达载体。重叠延伸PCR技术已被广泛应用，不仅可以应用于扩增长片段基因、定点突变和基因敲除等，而且在定点突变上的应用具有突变效率高、操作简单、成本低等优点[8]，但仍存在一些需要解决的问题。由于延伸获得的片段是经PCR扩增产生的，因此拼接的准确性一定程度上受PCR反应保真度的影响，并且该技术操作过程中很大一部分靠经验的指导，并没有标准的操作条件，对扩增未知序列仍然有一定的困难。

图4 测序结果Fig.4 The result of sequence

pYES2.0质粒是酿酒酵母穿梭载体，自身带有GAL1启动子、URA3和Amp抗性标记基因便于筛选。pYES2.0质粒属于非整合型载体，插入片段需带有启始编码子和终止子，含有多个克隆位点便于外源片段的插入，目前广泛运用于酿酒酵母内重组蛋白的表达。经酶切及序列分析可知，本研究已成功构建了酿酒酵母ADH2基因沉默表达载体pSADH2，可以进一步进行转化酿酒酵母及表达量的研究。

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