溶氧控制对黄色短杆菌YILW合成L-异亮氨酸的影响

白亚磊，徐庆阳，谢希贤，陈 宁

(工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

溶氧控制对黄色短杆菌YILW合成L-异亮氨酸的影响

白亚磊，徐庆阳，谢希贤，陈 宁

(工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

对黄色短杆菌YILW合成L–异亮氨酸的发酵溶氧条件进行了探索，构建了该菌合成L–异亮氨酸的代谢网络和代谢流平衡模型．在 30 L发酵罐中考察了不同溶氧浓度下 L–异亮氨酸发酵过程．研究结果表明：高溶氧浓度有利于菌体生长，15%溶氧浓度下产酸速率高且维持的时间长，有利于 L–异亮氨酸的积累．为此提出了分段控氧模式：在菌体生长期，溶氧浓度控制为 25%；在产酸稳定期，溶氧浓度控制为15%．在此溶氧控制模式下，在30 L发酵罐上补料分批发酵60 h，L–异亮氨酸产量可达31.8 g/L，糖酸转化率可达18.3%，且乳酸、丙氨酸等副酸明显减少．对此结果运用代谢流分析的方法进行论证，旨在从量的角度理解溶氧对 L–异亮氨酸合成的影响提供理论基础，对进一步优化 L–异亮氨酸发酵溶氧条件提供理论指导．

L–异亮氨酸；溶氧；分段控氧模式；代谢流分析

Abstract：The condition of dissolved oxygen of L-isoleucine synthesis in Brevibacterium flavum YILW was explored，and the metabolic networks and metabolic flux balance model were constructed. The fermentation processes were studied on the condition of different dissolved oxygen in 30 L fermenter. The results show that high dissolved oxygen leads to bacterium growth. Higher production ratio of L-isoleucine maintains a long time under the condition of 15% dissolved oxygen. Thus the grading-controlling mode of dissolved oxygen was proposed： 25%dissolved oxygen concentration in the cell growth phase and 15% dissolved oxygen concentration in the phase of acid stable. Under this strategy，the yield of L-isoleucine is 31.8 g/L in 30 L fermenter in 60 h，and the conversion of sugar to acid is up to 18.3%. The vice acid is reduced significantly such as lactic，alanine. The results was demonstrated by using the method of metabolic flux analysis，providing a theoretical basis for the in-depth understanding from the perspective of the amount of dissolved oxygen on L-isoleucine fermentation，and providing a theoretical guidance for further optimization of L-isoleucine fermentation condition of dissolved oxygen.

Keywords：L-isoleucine；dissolved oxygen；phase oxygen control model；metabolic flux analysis

L–异亮氨酸(Ile)是人体8种必需氨基酸之一，除用于一般营养型复合氨基酸输液、要素膳外，还大量用于配制治疗型特种氨基酸输液，如肝安、肾安氨基酸输液，对治疗各种肝脏疾病具有显著疗效[1]．

由葡萄糖直接合成 L–异亮氨酸的途径较长且复杂．常高峰等[2]通过对黄色短杆菌生产 L–异亮氨酸的发酵代谢分析得出，在 L–异亮氨酸的发酵过程中有缬氨酸、丙氨酸及乳酸等杂酸积累，副产物的生成造成了碳源的浪费．王健等[3]通过对 L–异亮氨酸的代谢途径分析得出，减弱TCA循环和乙醛酸支路，可以使更多的碳架流转向异亮氨酸的合成．宋文军等[4]研究表明，在 L–异亮氨酸生物合成中，若 TCA 途径流量过大，会导致 L–异亮氨酸的代谢流减少．故减弱TCA途径可以提高发酵过程中 L–异亮氨酸产酸水平．但是采取不同的措施，究竟对L–异亮氨酸的代谢流分布的影响有多大，尚未从量的角度给以阐释．

本文考察了不同阶段的溶氧供应量，确定了不同阶段最佳溶氧供应量；采用代谢流分析方法，定量地描述了溶氧条件优化前后黄色短杆菌YILW合成L–异亮氨酸代谢流的分布．为进一步改造菌种及优化发酵过程控制，从而提高 L–异亮氨酸的发酵得率提供理论依据．

1 材料与方法

1.1 菌株

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)YILW(LeuL＋AHVr＋SGr＋Leu-MEr)为天津科技大学代谢工程研究室保藏菌种．

1.2 培养基(g/L)

活化培养基：葡萄糖 1，酵母粉 5，蛋白胨 10，氯化钠 2.5，琼脂 25，pH,7.0～7.2，0.1,MPa灭菌 20,min．

种子培养基：葡萄糖30，酵母粉5，(NH4)2SO4,3，KH2PO4·3H2O,1.5 ，MgSO4·7H2O,0.6 ，FeSO4·7H2O,0.01，MnSO4·H2O,0.01，玉米浆 30,mL，豆饼水解液30,mL，pH,7.0～7.2，0.1,MPa,灭菌 15,min．

发酵培养基：葡萄糖 80，(NH4)2SO4,4，FeSO4·7H2O,0.015 ，MgSO4·7H2O,0.5 ，MnSO4·H2O,0.015 ，KH2PO4·3H2O,1.5 ，K2HPO4·3H2O,3 ，VH,100,µg ，VB15,mg，豆饼水解液 20,mL，玉米浆 15,mL，pH,7.0～7.2，0.075,,MPa,灭菌 15,min．

1.3 培养方法

活化斜面培养：31,℃恒温培养36,h．

5,L种子罐(上海保兴生物设备工程有限公司)培养：吸取适量无菌生理盐水于5支活化斜面中，将所有菌悬液接入装5,L种子罐中，初始装液量为3,L，初始通气量 2,L/min，搅拌转速 300～600,r/min，通过自动流加氨水控制 pH(7.0±0.2)，培养温度 31,℃，以泡敌消泡．培养12,h后，按10%接种量接入发酵培养基中．

30,L发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司)培养：按10%接种量将种子液接入30,L发酵罐中，初始装液量为 16,L，发酵中后期流加 80%液体葡萄糖，初始通气量1,m3/h；搅拌转速300～800,r/min；通过自动流加氨水控制pH(7.0±0.2)，培养温度 31,℃，以泡敌消泡，发酵60,h．

1.4 测定方法

菌体浓度测定：发酵液经蒸馏水稀释20倍后，在波长 560,nm 下用 V–1200型分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)测定吸光度．

菌体生物量测定：菌体生物量以菌体干质量表示，取10 mL发酵液，8 000 r/min离心10 min，将菌体用蒸馏水洗涤 2次后置于 DZF–6020型真空干燥箱(上海博迅实业有限公司)中，80,℃干燥至恒质量，用 FA2204B型分析天平(上海精密科学仪器有限公司)称质量．

溶氧及 pH测定(Oxyferm 225型溶氧电极、Easyferm Plus,225型pH电极，Hamilton公司)：在线测定．溶氧标定以饱和亚硫酸钠溶液中的氧气浓度为0，以空气中的氧气浓度为100%．

葡萄糖及乳酸浓度：采用 SBA–40C型生物传感仪(山东省科学院生物研究所)进行测定．

L–异亮氨酸、其他氨基酸浓度的测定：L–异亮氨酸及其他氨基酸含量采用 Agilent,1200型高效液相分析系统(Agilent Technologies公司)测定，色谱分离条件：Agilent C18(150,mm×4.6 mm，3.5,µm)为色谱分离柱，2，4–二硝基氟苯柱前衍生测定，乙腈与 NaAc溶液进行梯度洗脱，柱温 33,℃，流动相流量1,mL/min，检测波长360,nm．

1.5 数据处理

发酵过程中菌体比生长速率μ根据式(1)计算[5]

式中：X、x均为菌体量；t为时间．用 Origin绘图软件对实验数据进行微分计算，再用 Excel软件求解不同时刻的μ．

1.6 代谢流计算

MFA以拟稳态假设为基础，假设细胞内的中间代谢物均处于拟稳态，即其浓度变化速率为 0．本文采用 Vallino等[6]的方法，根据物料平衡按照式(2)计算代谢物的积累速率

式中：xj(t)为第 j步反应的反应速率，mmol/(L·h)；xk(t)为第 k 步反应的反应速率，mmol/(L·h)；αj为第 j步反应的反应计量系数；αk为第k步反应的反应计量系数；ri(t)为中间代谢物i的积累速率，mmol/(L·h)．

由拟稳态假定可得ri(t)＝0．代谢网络中的m个中间代谢物构成 m个代谢流平衡方程式，可写成式(3)矩阵形式

式中：A，m×n维矩阵；X，n×1维矩阵，n为选定的速率总数目．

这样由m个中间代谢物即可得到m个关于速率的约束条件，待解问题的自由度为 F＝n－m，通过实验测出F个不相关速率即可确定胞内整体流量分布，从而对其生理行为进行定量的描述．

2 结果与讨论

2.1 不同溶氧浓度条件对菌体生长的影响

由于菌体在不同生理阶段对氧的需求不同，溶氧过高或过低都对正常发酵过程不利．溶氧过高会导致后期菌的活力降低，溶氧过低会影响前期菌体的生长[7–8]．因此考察 5%、15%、25%、35%和 45%溶氧条件下对 L–异亮氨酸发酵过程中菌体量的影响，结果如图1所示．

图1 不同溶氧浓度条件对菌体生长的影响Fig.1 Different dissolved oxygen conditions on cell growth

由图 1可知：随着溶氧浓度的增大，比生长速率和生物量都在逐渐增大；当溶氧浓度达到 25%后，溶氧浓度再增加，比生长速率和生物量增加的幅度都很小．这表明当溶氧浓度控制在 25%、35%和 45%时，比较有利于细胞生长，可保持较快的生长速率，且在20,h后 3种情况下的菌体量基本达到稳定，高达21,g/L．当溶氧较低时，菌体的生长呼吸得不到满足，生长受限，致使菌体浓度过低，影响发酵中后期 L–异亮氨酸的产酸速率．综合考虑确定 25%溶氧作为菌体生长的最适溶氧浓度．

2.2 不同溶氧条件对产酸稳定期产酸速率的影响

根据上述菌体生长曲线可知，在发酵前 20,h基本上完成了菌体量的积累，20,h后进入产酸稳定期．以下考察了产酸稳定期，即发酵 20,h后，分别以5%、15%、25%、35%、45%的溶氧浓度控制时的产酸速率，结果如图2所示．

图2 不同溶氧浓度下的产酸速率Fig.2 Acid production rate under different dissolved oxygen

由图2可知：在5%溶氧条件下，虽然产酸速率比较稳定，但是产酸速率比较小，对 L–异亮氨酸的积累不利；在 35%和 45%溶氧条件下，虽然在产酸稳定期开始时有较高的产酸速率，但是随着发酵时间的延长，产酸速率呈下降趋势，对酸的积累也有影响；而在15%和 25%溶氧条件下，产酸稳定期开始时不但有较高的产酸速率，高达 0.6,g/(L·h)，而且较高的产酸速率维持的时间也较长，有利于L–异亮氨酸的积累．

2.3 L–异亮氨酸生物合成代谢流平衡模型的建立

2.3.1 代谢网络的构建

在黄色短杆菌中，存在 EMP、TCA 和 HMP途径，HMP途径能为氨基酸合成提供大量的还原力NADPH，在L–异亮氨酸合成中意义重大．

基于以下原则建立代谢网络：(1)细胞处于非生长时期或细胞浓度变化不大可以忽略；(2)细胞代谢过程中乙醛酸途径微弱，所以不考虑乙醛酸循环；(3)反应途径产生的NADPH与TCA循环、HMP途径产生的NADPH总数相等；(4)在细胞生长不旺盛阶段，由于大量无效循环的存在，ATP 的消耗量和细胞维持能总量并不相等，因此本文不考虑 ATP总量的平衡；(5)按固定比例进行的反应以及无分支的中间反应，尽量简化为一个反应方程；(6)本文所用菌株为亮氨酸渗漏型，所以不考虑亮氨酸支路．L–异亮氨酸合成代谢网络图如图3所示．

图3 L–异亮氨酸生物合成代谢网络Fig.3 Biosynthesis metabolic network of L-isoleucine

2.3.2 代谢流平衡模型方程组的建立

根据以上分析及有关的文献[9]报道，代谢节点处的方程如下：

方程组由 19个方程组成，27个未知数，自由度为 8，只需要测定发酵液中 8种物质的反应速率就可确定代谢流的分配情况，在本实验所用的发酵液中检出葡萄糖、异亮氨酸、丙氨酸、赖氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、谷氨酸及乳酸的浓度，计算各自的消耗或积累速率，结果见表1．

表1 产酸稳定期主要代谢产物变化速率Tab.1 Variation rate of major metabolite in the phase of acid stable

利用 Matlab软件linprog函数，结合表1中测得的代谢物的消耗或累计速率，为了便于计算，葡萄糖摩尔消耗速率假定为 100,mmol/(L·h)，求得两种溶氧条件下的代谢流分布如图4所示．

进入产酸稳定期，菌体基本不再增长，碳架导向L–异亮氨酸的合成．天冬氨酸为 L–异亮氨酸生物合成的前体，增大天冬氨酸的代谢流可以提高 L–异亮氨酸产量，而天冬氨酸又由草酰乙酸合成，因此，增大磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的流量有利于更多的碳架流向目的产物．HMP途径作为提供 NADPH的主要途径，增大HMP途径的代谢流是提高L–异亮氨酸生物合成所必需的[10]．由图 4可以看出：产酸稳定期内，在 15%和 25%溶氧条件下，由磷酸烯醇式丙酮酸通往草酰乙酸的r17流量分别为31.78,mmol/(L·h)和 30.11,mmol/(L·h)，其中流向 L–异亮氨酸分别为25.38,mmol/(L·h)和 24.30,mmol/(L·h)；通往 HMP 途径的 r,6流量分别为 20.51,mmol/(L·h)和 11.06,mmol/(L·h)；同时在 15%溶氧条件下，乳酸、丙氨酸等副酸比在 25%条件下的流量要小．比较两种情况下的代谢流分布，在15%溶氧下的代谢流分布比在25%溶氧下的更有利于 L–异亮氨酸的积累．故在产酸稳定期，在 15%溶氧控制条件下，更多的碳架导向了 L–异亮氨酸的合成．这也说明了图 2中 15%溶氧条件下比在25%溶氧下产酸速率高的原因．

综上所述，发酵前期是菌体生长旺盛的时期，L–异亮氨酸合成量较少，提高溶氧浓度有利于菌体生长，25%溶氧较为适合生长期菌体生长需要．在产酸稳定期，菌体浓度基本不变，L–异亮氨酸大量合成，降低溶氧浓度，可增加前体物质天冬氨酸和NADPH的量，使得通往 L–异亮氨酸的代谢流增加．运用代谢流分析可知：15%溶氧下更有利于产酸稳定期 L–异亮氨酸的积累．

图4 产酸稳定期的代谢流分布图Fig.4 Metabolic flux distribution in the phase of acid stable

2.4 产酸稳定期两种控氧模式下 L–异亮氨酸及主要副酸的变化情况

在产酸稳定期控制不同溶氧，由图5两种溶氧控制策略下的目的产物与副酸的累积量可知：在 15%溶氧条件下，目的产物 L–异亮氨酸的累积量比在 25%溶氧条件下的大；而乳酸、丙氨酸等副酸的累积量相对 25%溶氧下有所减少，这与上述代谢流分析结果是一致的．

图5 产酸稳定期的主产物与副酸累积量Fig.5 Accumulation of the main product and vice acid in Fig.5 the phase of acid stable

3 结 论

在 L–异亮氨酸发酵过程中，在不同溶氧条件下，L–异亮氨酸的累积量有很大的不同，15%溶氧时为31.8,g/L，25%时为 27.3,g/L．因此根据代谢流分析结果确立了溶氧分段控制模式：菌体生长期，维持溶氧25%；产酸稳定期，维持溶氧 15%．在该溶氧控制模式下，通过 30,L罐补料分批发酵 60,h，产酸可达31.8,g/L，糖酸转化率可达 18.3%，同时副酸的积累也大大下降．由此说明，在 L–异亮氨酸发酵过程中，溶氧的控制对发酵过程有很大的影响，在不同的阶段控制不同的溶氧水平，不但对目的产物的累积量有很大影响，同时对副产物的积累也有很大的影响，副酸的减少不但可以减少发酵过程中的原料浪费，而且还对下游提取工作有利，可以降低提取难度和减少提取过程中的能耗．

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Effect of Dissolved Oxygen Control on L-isoleucine Synthesis by Brevibacterium flavum YILW

BAI Ya-lei，XU Qing-yang，XIE Xi-xian，CHEN Ning
(Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Q815

A

1672-6510(2011)01-0005-05

2010-09-10；

2010-11-16

天津市应用基础及前沿技术研究计划项目(08JCZDJC15400)

白亚磊（1985—），男，河南平顶山人，硕士研究生；通信作者：陈 宁，教授，ningch@tust.edu.cn.