柠条叶蛋白碱性提取的响应面分析法优化

刘 杰，贾士儒，钟 成，李 宾，范利花

(工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

柠条叶蛋白碱性提取的响应面分析法优化

刘 杰，贾士儒，钟 成，李 宾，范利花

(工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

柠条是一种粗蛋白含量较高的灌木，而且富含全部的人体必需氨基酸．从丰富的柠条资源中提取蛋白对于部分缓解我国目前的蛋白质资源紧缺以及环境保护等问题具有积极作用；因此，通过 Box-Behnken实验设计进行柠条叶蛋白碱性提取的响应面优化，得到了适当的模型，并确定了重要参数的最佳水平．根据系统给定的参数得到的预测值与实测值相当接近；柠条叶蛋白提取的最佳工艺条件为：NaOH溶液浓度0.12,mol/L，絮凝pH,2.9，温度75,℃．最终可得柠条叶蛋白浓缩物相对得率(RLPCY)和蛋白相对得率(RPY)分别为16.2%和41.5%．

柠条；叶蛋白；碱性提取；响应面法

Abstract：Caragana microphylla Lam. is shrub with high protein level and all of the essential amino acid. Extracting protein from C. microphylla Lam. offers good alternative to partly eliminate protein shortage and improve environmental concerns in China. Leaf protein alkaline extraction was optimized by Box-Behnken design coupled with response surface methodology，and a regressive model was obtained. The predicted values matched well with the experimental data within the given experimental conditions. The optimal technological parameters were optimized as follow：concentration of NaOH 0.12 mol/L，flocculation of pH 2.9 and flocculation of temperature 75,℃. In optimized condition，the relative leaf protein concentrates yield(RLPCY)and relative protein yield(RPY)of C. microphylla Lam. could reach 16.2% and 41.5% respectively.

Keywords：C. microphylla Lam.；leaf protein；alkaline extraction；response surface methodology

柠条是锦鸡儿属(Caragana Fbar.)植物栽培种的通称，为典型的欧–亚草原植物地区落叶灌木，具有萌孽力强、易成林、抗寒、抗旱、耐贫瘠、根系发达可固氮等特性，是我国北方干旱、半干旱地区水土保持、防风固沙的先锋植物[1]．由于柠条具有相对较高的蛋白质含量，通常含粗蛋白 14.9%～23.1%(干质量)[1]且必需氨基酸含量较为丰富[2]，因此，开发其作为饲料应有较大的实用价值．但是，无论是直接饲用还是微生物发酵后饲用，其适口性均较差[3–5]，所以，从柠条中提取蛋白质作为饲料添加剂，有可能是一条利用柠条的有效途径．为此，本文根据柠条等植物蛋白质的溶解特性[6]，研究了提取工艺参数对柠条叶蛋白提取的影响，采用Box-Behnken方法对碱性提取过程进行了优化，并对回归模型进行了验证．

1 材料与方法

1.1 材料来源与处理

柠条(小叶锦鸡儿，C．microphylla Lam.)，采自内蒙古凉城县，包括枝和叶．自然风干后粗蛋白含量为12.9%，水分含量为7.46%．

先将自然风干的柠条枝叶采用 FZ102微型植物试样粉碎机(河北省黄骅市齐家务科学仪器厂)进行粉碎，再过 20目标准筛(浙江上虞市华康化验仪器厂)，然后直接加入水(单因素实验)或NaOH溶液(优化实验)进行浸提，过滤，再采用 pHSJ–4A 型实验室pH 计(上海精密科学仪器有限公司)，采用 1.0,mol/L的HCl或0.1 mol/L的NaOH溶液调节滤液pH后进行水浴加热，再以 CR22G型离心机(日本 Hitachi公司)5,000,r/min离心 10,min，最后干燥得柠条叶蛋白浓缩物[7]．

1.2 蛋白质定量方法

柠条粉碎样品粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定[8]．

蛋白提取液蛋白含量以Bradford法[9]进行检测，并以牛血清蛋白(Albumin Fraction V冻干粉，美国Genview公司)作为标准蛋白，在722,s型可见分光光度计的595,nm处检测吸光度，制作标准曲线．

其中，涉及到的相关计算公式如下：柠条叶蛋白溶出率＝(溶出的蛋白量/柠条样品中的粗蛋白量)×100%；蛋白沉淀率＝(提取液中沉淀出的蛋白量/提取液中所溶解的蛋白总量)×100%；柠条叶蛋白浓缩物相对得率＝(柠条叶蛋白质量/[柠条质量×(1–柠条的水分含量)])×100%；蛋白相对得率＝柠条叶蛋白中的蛋白含量/柠条干物质粗蛋白含量)×100%．

1.3 单因素实验与碱性提取的优化

单因素实验中，考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)，浸提时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5,h)，NaOH 溶液浓度(0.00、0.01、0.05、0.10、0.50,mol/L)对柠条叶蛋白溶出的影响；考察絮凝pH(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)，加热时间(5、10、15、20、25,min)，加热温度(50、60、70、80、90,℃)对蛋白沉淀的影响．响应面优化实验中，选取了对柠条叶蛋白提取影响相对较大的 3个因素：NaOH溶液浓度、絮凝pH和加热温度．

碱性提取的优化实验中，以Box-Behnken实验设计研究NaOH溶液浓度、絮凝 pH和絮凝温度对柠条叶蛋白浓缩物相对得率(RLPCY)和蛋白相对得率(RPY)的影响．每次实验进行3次，每个样品检测3次．

1.4 数据分析

单因素实验数据采用Origin 8.0进行分析，优化实验所得响应值均采用Design Expert,7.1.3来研究其显著性(P＜0.05)，并进行方差及回归分析．

2 结果与讨论

2.1 工艺参数对柠条叶蛋白溶出和沉淀的影响

考察料液比、浸提时间、NaOH浓度对柠条叶蛋白溶出的影响，结果如图 1所示．适宜的条件是料液比为 1∶20，浸提时间为 1,h，NaOH 溶液浓度为0.10,mol/L．

图1 工艺参数对柠条叶蛋白溶出的影响Fig.1 Effect of technological parameters on solubilized leaf protein of C. microphylla Lam.

由图1可以看出，料液比和浸提时间对柠条叶蛋白溶出率的影响相对较小，其最佳条件时的溶出率也不到9%；但对于NaOH溶液来说，则影响显著，当其浓度由0.01,mol/L增加到0.10,mol/L时，柠条叶蛋白的溶出率从总蛋白的14.2%增加到了42.6%；进一步增加NaOH溶液浓度到0.50,mol/L时，柠条叶蛋白浓缩物及蛋白相对得率提高得不多．增加 NaOH溶液浓度，有可能在破坏柠条的细胞结构上起较大的作用，可使细胞内的蛋白溶出，这与Bals等[10]运用 NaOH 溶液从酒糟中提取蛋白质的研究结果相似．但他们最高得到不足总蛋白量30%的蛋白质，而本研究可以得到将近50%的总蛋白溶出量，这可能是所用原料本身所含蛋白的不同所致．另外，加入更多的碱达不到预期的效果，还会增加后续的沉淀工序中酸的用量，使成本增加，所以确定NaOH溶液的浓度为0.10,mol/L．

絮凝因素对溶出叶蛋白沉淀的影响如图 2所示．调节蛋白提取液的 pH对柠条叶蛋白沉淀影响大，适宜的絮凝 pH 为 3.0(图 2(a))．以 70,℃作为絮凝温度研究加热时间的影响，发现其对叶蛋白沉淀影响较小，故此，确定絮凝加热时间为 5,min即可(图2(b))．而加热温度对叶蛋白沉淀的影响较大，从 50,℃的 88.5%到 90,℃的 97.2%有 9.80%的提高，而当温度为 80,℃时，就已有 95.5%的叶蛋白被沉淀出，故确定絮凝温度为80,℃(图2(c))．

图2 工艺参数对柠条叶蛋白沉淀的影响Fig.2 Effect of technological parameters on coagulated leaf protein of C. microphylla Lam.

2.2 响应面法优化柠条叶蛋白的提取

2.2.1 回归模型的建立

依据Box-Behnken实验设计进行实验，得到如表1所示的相应结果，以Design Expert 7.1.3软件，得出了各自的回归方程：

2.2.2 回归模型的显著性分析

由模型预测出RLPCY和RPY值与实测值相关性较高，其相关系数分别为0.92和0.99．

3个影响因素对柠条叶蛋白浓缩物相对得率和叶蛋白相对得率均具有显著的二次效应．其中，NaOH溶液浓度影响显著，可以通过其显著线性项(RLPCY和RPY分别为＋2.397,5和＋5.788)和2次项(RLPCY和 RPY分别为－8.1和－24.116,7)来直接描述．

在3个因素间，NaOH溶液的浓度与絮凝pH的交互效应最大，NaOH溶液的浓度与絮凝温度次之，絮凝pH与温度最小，所以，NaOH溶液的浓度与絮凝pH这两个因素对于柠条叶蛋白浓缩物及蛋白相对得率影响显著．

2.2.3 在优化的碱性条件下提取蛋白质

NaOH溶液浓度对于柠条叶蛋白浓缩物和蛋白相对得率的影响如图 3所示．使用碱液浸提，得到最大RLPCY和RPY值时具有较适宜的NaOH浓度和絮凝pH．

2.2.4 模型的验证

根据以上所得出的优化条件进行模型的验证．实验所得结果与预测结果进行比较(表 2)，2个实测值均在 99%的预测区间内，故所得模型的稳定性良好，并能够反映上述参数对RLPCY和RPY的影响．

3 结 论

采用 Box-Behnken实验设计，对柠条叶蛋白提取的工艺条件进行3因素3水平的响应面优化分析，确定其最佳工艺条件为：NaOH溶液浓度0.12,mol/L，絮凝 pH,2.9，加热温度 75,℃．此时，柠条叶蛋白浓缩物相对得率为16.2%，蛋白相对得率为41.5%．

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Optimization of Leaf Protein Alkaline Extraction from Caragana microphylla Lam．by Response Surface Methodology

LIU Jie，JIA Shi-ru，ZHONG Cheng，LI Bin，FAN Li-hua
(Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China )

Q946.1

A

1672-6510(2011)01-0001-04

2010-09-03；

2010-11-18

国家科技支撑计划项目(2007BAK36B05-4)；天津科技大学引进人才科研启动基金资助项目(20100413)

刘 杰（1982—），男，湖北潜江人，硕士研究生；通信作者：贾士儒，教授，jiashiru@tust.edu.cn.