大鼠脑为底物间接免疫荧光法检测谷氨酸脱羧酶抗体的研究

陈志英,白 梅,孟 和,其其格

(解放军第253医院,内蒙古呼和浩特010051)

谷氨酸脱羧酶(GAD)是抑制性神经递质γ-氨基丁酸的合成酶。1990年Beakkeskov等首次证明是1型糖尿病(T1DM)的自身抗原。T1DM患者体内存在多种针对胰岛自身抗原的抗体,以GAD-Ab、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2A)及胰岛素抗体(IAA)最为常见,其中GAD-Ab是最早出现的自身抗体[1]。测定血清GAD-Ab,首先要有抗原,作为GAD抗原的替代物有六种之多[2],鉴于容易获取、成本低等优点,所以我室尝试选择大鼠脑组织做基质。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 标本来源 经临床诊断符合WHO制订的糖尿病诊断标准患者80例:32例1型糖尿病8-32岁,平均20.6岁;48例成人晚发隐匿性自身免疫性糖尿病18-44岁,平均36.9岁。正常对照组80例,选自体检正常人群,年龄18-35岁,平均30.1岁。所有对象均于晨采空腹静脉血,立即离心分离血清-80℃保存待测。

1.1.2 实验试剂 FITC标记的兔抗人IgG抗体(上海生物制品所),GAD标准品(Sigma公司提供),BALB/c小白鼠脑印片,Wister大白鼠脑印片,正常人胰腺组织片;GAD-Ab检测用ELISA试剂盒(进口分装)(北京市福瑞公司提供)。

1.1.3 主要仪器 奥林巴斯万能显微镜,培养箱。

1.2 实验步骤 待检血清标本1∶80(已知阳性)稀释后滴加在抗原底物上,保湿37℃孵育40分钟,洗涤后,滴加适当浓度的标记物工作液,保湿37℃孵育40分钟,洗涤,封片镜检。均做平行测试。

1.2.1 ELISA检测 严格按试剂盒说明书操作。

1.2.2 结果判读 1∶80滴度待检血清未见足量荧光标记物(≤10个/视野),则判为GAD-Ab阴性;否则为阳性-并记录可测最高滴度。

1.2.3 统计学处理 率及例数分布用卡方检验,P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 标记物工作浓度确定 固定其他实验条件,标记物工作液1∶200试验结果最好。

2.2 最佳温育时间 固定其他实验条件,结果37℃40分钟最佳。

2.3 试验的特异性和灵敏度 试验结果显示试验灵敏度97.5%(80例患者中检出78例阳性);试验特异性97.5%(正常对照组80例检出2例阳性)。

2.4 方法比对

2.4.1 大白鼠脑、人胰腺抗原片检测结果见表1。

表1 大白鼠脑、人胰腺抗原片检测结果比较

2.4.2 与ELISA比较 ELISA检测80例中阳性79例,阴性1例;本方法阳性 78例,阴性2例,r=0.996,两种方法显著正相关。

3 讨论

已有研究表明:GAD-Ab在胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)发病前7-8年就可被检出,而且发病后相当长的时间内持续存在,伴随着胰岛功能残留而持续存在,这对IDDM预报提供了良好的帮助;对成人晚发隐匿性自身免疫性糖尿病的鉴别诊断具有重要价值。抗-GAD阳性患者中,由于体内存在自身抗体,与GAD结合后影响了GABA的合成速度,干扰了胰岛素合成及分泌的调节,继而使胰岛β-细胞的功能受到影响,导致体内循环中胰岛素之不足。我国昆明报道GAD-Ab在DM1患者阳性率61.3%,江苏南通报道阳性率67.39%[4];河南新乡报道阳性率41.7%(5/12)[3];新疆克拉玛依地区报道阳性率为68.5%[5]。有研究者认为GAD-Ab预测DM1的特异性为100%,敏感性为82%;通过多因素分析排除年龄、性别和BMI的影响后:GAD-Ab阳性预示更差的胰岛功能,由此提示测定GAD-Ab于DM1诊疗中的重要性。

目前在临床实验中,GAD-Ab的检测有多种方法:中南大学湘雅二院周智广等于1997年建立并于2004年进一步优化的“放射配体检测法”;其他还有放射免疫法[6];酶免法[3];增敏化学发光免疫分析法[4]及斑点金免疫渗滤法等。鉴于大鼠脑GAD65和人GAD65的氨基酸序列具有高度同源性。本设计以大鼠脑为检测底物,取代相对难获取的人胰组织,建立改良的间接免疫荧光法,主要着染胶质细胞的胞质。该方法稳定性、重复性均好,与ELISA结果一致;特异性符合检验要求,而且价廉、简便,易于推广,特别适于1型糖尿病流行病学研究和初筛预报。

[1]Tisch R,Yang X D,Singer SM,et al.Immune response to glutamic acid decarboxylase correlates with insulitis in nonobese dibetic mice[J].Nature,1993,1:72.

[2]李 霞,周智广,黄 干,等.谷氨酸脱羧酶抗体水平对两种成人自身免疫糖尿病的亚型的识别[J].中华内科杂志,2003,1:7.

[3]王卫民,张清贵,翁考刚,等.谷氨酸脱羧酶抗体和血、尿C肽在糖尿病中的临床应用[J].中国医药导报,2008,5:61.

[4]周锦红,刘振宗,王惠民.糖尿病检测谷氨酸脱羧酶抗体,胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体的临床意义[J].标记免疫分析与临床,2006,3:145.

[5]于 帆,杨媛魁,王福刚,等,血清中三项抗体和胰岛素在糖尿病分型中的意义[J].检验医学与临床,2008,5:289.

[6]李 旭,韩松涛.糖尿病患者餐后高血糖与谷氨酸脱羧酶抗体、β2-微球蛋白和HbAlc测定[J].北华大学学报,2008,1:37.