左旋芹菜甲素注射液对大鼠局灶性脑缺血损伤的影响

朱 辉,吴晓冬,杨绍娟

(1.吉林大学第一医院神经内科,吉林长春130021;2.吉林大学中日联谊医院中心研究室,吉林长春130033)

缺血性脑血管病是严重威胁人类健康的常见病和多发病,其发病率在不断增高[1],病理过程涉及复杂的机制,目前有效的治疗手段仍然缺乏。左旋芹菜甲素注射液(dl-3-n-butylphthalide,NBP)是从芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素,对急性缺血性脑卒中患者的中枢神经功能的损伤有改善作用,可促进患者功能恢复,其口服药恩必普已经问世,是我国脑血管治疗领域的第一个拥有自主知识产权的国家一类新药,但是其注射液目前还没有应用于临床。我们课题组对左旋芹菜甲素注射液对脑缺血的梗塞面积、神经功能恢复及凋亡的发生改变进行了进一步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性健康Wistar大鼠,体重280-320 g,共60只。随机分为对照组和左旋芹菜甲素注射液治疗组,制备成大鼠大脑中动脉阻断局灶性脑梗塞动物模型(MCAo),在MCAo术后半小时尾静脉注射左旋芹菜甲素注射液(20 mg/kg),共注射七天,对照组注射同体积的生理盐水。第一天处死20只,第四天处死20只,第七天处死20只。

1.2 实验试剂 左旋芹菜甲素注射液(恩必普药业提供);RT-PCR试剂盒(TAKARA);引物合成(上海生物工程公司);4%福尔马林固定液(Promega);0.01PBS(Promega)。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠大脑中动脉阻断局灶性脑梗塞动物模型的制备 本实验动物在手术前8-12小时禁食,参照Koixumi[2]和Longa[3]发明的腔内线栓法制备大鼠左侧大脑中动脉局灶性脑梗塞动物模型(MCAo),插入尼龙线1小时。拔出后半小时大鼠尾静脉注射左旋芹菜甲素注射液,浓度为20 mg/kg,对照组注射同体积的生理盐水,回笼饲养。

1.3.2 神经功能缺失评分 我们采用16分制[4]的神经功能评分方法对大鼠的神经功能进行评定。0分为正常,1-4分为轻度损伤,5-9分为中度损伤,10分以上为重度损伤。

1.3.3 处死各组动物 用水合氯醛腹腔注射,待对疼痛刺激无反应时,自中线剪开腹腔及胸腔,暴露心脏,用套管针穿刺左心室,拔出针芯,将管头置于升主动脉开口处,剪开右心耳,从导管内快速注入冰PBS缓冲液,待肝脏颜色变白后,改用4%福尔马林PBS固定液灌注。用咬骨钳咬开颅骨,取出脑标本。

1.3.4 梗塞面积测定 选择视交叉水平的脑组织切片,HE染色后利用图象分析仪测定损伤面积、同侧半球面积和对侧半球面积。用损伤面积/同侧半球面积×100%,表示梗塞面积程度。

1.3.5 Caspase3的表达 按 RT-PCR试剂盒说明书,对处死动物取新鲜的脑组织,提取mRNA,经过RT-PCR检测Caspase3的表达。Caspsae3引物序列上游:5′-TGC GGC GTT ACA CGA CCT T-3′;下游 :5′-CAA AGC CAG TGG CAC TCA TTC TC-3′产物长度200 bp;β-actin 上游 :5′-GAA ACT ACC TTC AAC TCC ATC-3′;下游 5′-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3′产物长度300 bp。以120V电压电泳30分钟,在凝胶成像系统下观察,扩增产物进行面积灰度扫描,以灰度代替表达量;靶基因灰度/β-actin灰度,即为靶基因mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分 我们采用16分制的神经功能缺损评分方法评定结果显示,左旋芹菜甲素注射液治疗组和对照组比较在手术后四天开始有显著差异,用药组恢复明显增快(P＜0.05)(见表1)。

2.2 病理学检查 HE染色后利用图象分析仪测定损伤面积,在术后四天、七天左旋芹菜甲素治疗组和对照组损伤面积差异显著(P＜0.05)(见表2)。

表1 神经功能缺损评分结果

表2 梗塞面积测定

2.3 Caspase 3表达 在第四天和第七天组有Caspase3表达量的减少(P＜0.05)(见表3)

表3 Caspase3 mRNA相对含量表达(灰度值)

3 讨论

脑缺血再灌注后脑损伤的发病机制较复杂,有多个病理环节参与,是一个多基因和多靶点参与的过程。与自由基的生成、炎症反应、Caspase-3的表达、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、基因活化、线粒体功能障碍等很多因素有关[5]。目前在国内外有关脑缺血的治疗方法其效果都还不理想。

从安全性角度讲,左旋芹菜甲素注射液源于天然植物,安全性很好,副反应低;在缺血性脑卒中的各个治疗阶段都可以使用,突破了溶栓药物6个小时的治疗”时间窗”限制。我们通过静脉给予左旋芹菜甲素注射液,探讨左旋芹菜甲素注射液在大鼠局灶性脑缺血脑组织中对细胞凋亡的研究,及对神经功能恢复和梗塞面积的影响。

我们首先制备了缺血性脑血管病的动物实验模型,采用Koizumi[2]和Longa[3]发明的腔内线栓法来制作大鼠局灶性脑缺血模型(MCAO),该模型不需开颅,对全身影响小,重复性好,缺血部位恒定,较好地模拟了临床脑梗塞的发病过程。另外由于神经功能缺损评定是一个重要的判定脑保护的指标,所以我们采用16分制的神经功能评定标准对大鼠的神经功能进行评定,从MCAo手术后4小时开始,每天一次。结果表明在术后第四天开始,对照组和用药组之间开始出现有统计学意义的显著差异,说明对于局灶性脑缺血大鼠,用药组的神经功能缺损恢复的速度快而且完全,提示我们左旋芹菜甲素注射液在急性缺血性脑血管病中具有神经保护作用。

选择视交叉水平的脑组织切片,HE染色显示左旋芹菜甲素注射液治疗组在第四天即有损伤面积的明显缩小,且梗死灶周边区域细胞形态变化较轻。到第七天更明显,由此说明左旋芹菜甲素注射液也能显著减少梗塞的面积,这也可能是神经功能恢复比对照组快的原因之一。

Caspase对神经元凋亡的发生起关键作用。已经明确凋亡存在着三条细胞信号传导途径[5,6]:死亡受体途径、线粒体途径及其内质网途径。最经典的是细胞内外各种死亡信号诱导线粒体释放Cytoc,再与Apaf-1和procaspase-9结合,形成Cyto-c Apaf-1 procaspase-9即”凋亡小体”(apoptosome),使 procaspase-9活化并激活下游的caspase3。但无论哪一条途径都有caspase3的密切参与。我们也同样检测到用左旋芹菜甲素注射液治疗后,第四天和第七天都有caspase3表达下降,表明左旋芹菜甲素注射液通过下调Caspase3的表达,引起大鼠局灶性脑缺血后神经元细胞凋亡的减少。最近国内也有人报道左旋芹菜甲素能够通过抑制细胞色素-C的释放[7],下调Caspase8的表达来抑制凋亡,保护神经元,与我们的实验结果是相吻合的,另外caspase 3的抑制剂可显著抑制缺血易损区caspase 3的活性、阻止PARP的裂解,从而抑制神经元凋亡改善神经功能[5]。Caspase的抑制剂Z-VAD-fmk可以促进神经功能恢复,减少梗塞发生[8]。这些都说明Caspase在脑缺血的神经细胞凋亡中起到重要作用。

我们通过静脉给予左旋芹菜甲素注射液,可以减少大鼠局灶性脑缺血脑组织中细胞凋亡,加快神经功能恢复,并且减少梗塞面积,也由此说明左旋芹菜甲素注射液不但通过口服,静脉也可以达到所需效果,成为急性缺血性脑梗死的临床治疗的又一有效手段。

[1]李 惠.缺血性脑血管疾病[M].北京:北京科学技术出版社,2002,47-57.

[2]Koizumi JY,Nakazawa TO,Ooneda G.Experimental studies of ischemic brain edema:a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J].Jpn J Stroke,1986,8:1.

[3]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20:84.

[4]Gelmers HJ.Calcium-channel blockers:effects on cerebral blood flow and potential uses for acute stroke[J].Am J Cardiol,1985,55(3):144B.

[5]Tanaka H,Yokota H,Jover T,et al.Ischemic preconditioning:neuronal survival in the face of caspase-3 activation[J].J Neurosci,2004,11:2750.

[6]Chen J,Nagayama T,Mitsumoto Y,et al.Induction of caspase-3-like protease may mediate delayed neuronal death in the hippocampus after transient cerebral ischemia[J].J Neurosci,1998,18(13):4914.

[7]王建华,刘瑞珍.丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞色素-C的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2010,8:320.

[8]朱 辉,吴晓冬,吉田泰二.延迟注射Z-VAD-fmk对局灶性脑缺血神经功能及梗塞面积的影响[J].中风与神经疾病杂志,2009,26(2):149.