化疗药对结直肠癌细胞株SW1116中DCC基因影响的实验研究

王旭东,姜洪伟,张 伟,王海珠,朱宝平,陈 明,梁国栋,徐 华

(1.吉林大学第二临床医院普通外科,吉林长春130041;2.内蒙古自治区医院肿瘤科;3.长春中医药大学附属医院)

结直肠癌是我国较常见的严重危害人民健康的恶性肿瘤之一,世界范围的流行病学调查资料表明,在各类恶性肿瘤中,结直肠癌的发病率占第3位,仅次于胃癌和肺癌的第三位恶性肿瘤,结直肠癌已成为危害人们身体健康的严重疾病。肿瘤发生、发展是多基因、多阶段的过程,癌基因的激活与抑癌基因的失活及异常被认为是肿瘤的发生的重要的分子机制。结直肠癌治疗方式主要是手术治疗,术前化疗,放疗可使肿瘤缩小,术后化疗,放疗可预防肿瘤复发和转移,而化疗药如何使抑癌基因发挥抑癌效应是目前研究热点[1],本文就常用化疗药(顺铂和5氟尿嘧啶)对结直肠癌细胞株SW1116DCC基因影响加以阐述。

1 材料与方法

1.1 标本 SW1116细胞株购自中科院上海生物研究所。

1.2 主要试剂 TRIzol Reagent(Invitrogen公司)。Taq DNA聚合酶,dNTP,DL2000 DNA Marke,AMV Reverse Transcriptase,Low Protein Marker(均购自宝生物工程有限公司)。RNase抑制剂;丙烯酰胺;N,N'-亚甲双丙烯酰胺;N,N,N,N'-四甲基乙二胺;十二烷基硫酸钠(SDS);四甲基乙二胺(TEMED)均购自Sigma公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞的化疗药处理方法 取对数生长期的SW1116细胞,计数,调细胞浓度5×105,加入6孔板,分别加入 3.0 μ g/ml的 DDP,260 μ M 的 5-Fu。作用6 h、12 h、24 h后,提取细胞的mRNA和蛋白备用。

1.3.2 化疗药对DCC基因的影响 引物的设计与合成:严格按照引物设计原则。本研究所用引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。上游引物:5′-AAGCTTCCGCCACCATGACAGTCTTGGTTCCGCCATG-3′,下游引物:5′-CTCTCTCTCGAGCTAACTGGAGCTTGGGATAGCAGGC-3′。

我们采用RT-PCR法研究常用化疗药对DCC基因转录的影响,采用Western-Blot法化疗药对DCC蛋白表达的影响。

2 结果

2.1 RT-PCR法检测 DDP、5-Fu处理的SW1116中DCC基因的转录影响见图1。从图1可以看出,以RT-PCR法杂交出的特异性条带的灰度值高低来判断不同化疗药物作用不同时间对结直肠癌细胞株SW1116中DCC基因转录的影响。顺铂和5-氟尿嘧啶可以促进DCC基因转录的表达,6小时开始上升,12小时表达量最高,随着时间的增加,DCC基因的转录开始下降,细胞生长明显减慢,24小时达低值。

图1 RT-PCR法检测 DDP、5-Fu处理的SW1116中DCC基因的转录

2.2 DDP、5-Fu处理的SW1116中DCC基因的蛋白影响 见图2。从图2可以看出:western blot杂交出的特异性条带的灰度值高低来判断不同化疗药物作用不同时间对结直肠癌细胞株SW1116中DCC蛋白表达的影响。顺铂和5-氟尿嘧啶作用结直肠癌细胞株SW1116,可以促进DCC蛋白的表达,并且在6小时DCC蛋白表达开始上升,12小时更加明显,表达量最高,细胞生长明显减慢,24小时达低值。结果表明DCC基因表达水平降低或缺失在结直肠癌的发生发展及转移过程中可能起了重要的作用,尤其对大肠癌细胞转移浸润过程的影响更为明显,说明常用化疗药物可通过使癌细胞表达DCC量的上升来实现其抗癌作用。

图2 Western-Blot法检测DDP、5-Fu处理的SW1116中DCC基因的蛋白表达

3 讨论

DCC基因定位于人染色体18q21.3,全长300-400 kb,至少含有28个外显子,cDNA长约4 341 bp。Cho等从基因库里分离出含所有已知编码序列的噬菌体,克隆其完整全长1.4 Mb,确定了第29号外显子的存在,并确定了每个内外显子的边界序列。DCC基因的表达蛋白是Ⅰ型跨膜糖蛋白,由1447个氨基酸组成,相对分子质量为190 KD,该蛋白主要包括3个功能区,即胞外区、跨膜区和胞内区,该膜糖蛋白在许多研究中被指出与细胞分化有关。该基因为肿瘤抑制基因[2]。该基因的最重要的功能已经在神经系统中被描述为netrin-1的受体。结肠癌缺失基因敲出的小鼠证实了这个基因在肿瘤转移方面的一个很重要的角色,然而质疑了该基因在肿瘤抑制的意义和作为黏液受体方面的不同。结肠癌缺失基因转染HT-29人结肠细胞会增加细胞之间的黏附性,损害细胞之间的物质交换,细胞和细胞之间以及细胞和基质之间黏附结构在不同组织之间细胞正常结构的保持和发展有关的迁移起着重要作用,以及组织重构和病理状态,连接复合体连接着细胞外基质的配体和邻近细胞为骨架提供细胞表面的化学信号提供分子支持。在人体上,细胞外骨架蛋白细胞外基质和邻近细胞连接起来,特别是在信号传导中。一个大的黏附蛋白家族包含着免疫球蛋白,以各种各样的免疫球蛋白和纤维蛋白III的出现为特征。发现与神经系统发育中的轴突导向有关,并且是细胞凋亡的诱导因子之一。这些基因编码细胞内转换子,作用于TGF-β配体家族成员的信号转导途径[3]。

5-FU对肿瘤杀伤作用的强弱,直接与抑制胸苷酸合成酶的程度有关,亦即决定于三元复合物的稳定性。顺铂的活性受溶液中的氯离子的影响极大,在生理盐水中其活性在24小时以上是稳定的,但是在不含氯离子的溶液中,其活性每小时减少10%[4]。顺铂在体液条件下,由于体液的氯离子浓度高,它大部分以原型化合物的形式存在,但是当其进入低氯离子浓度的细胞内,其氯基被代谢。代谢产物荷正电,它具有类似于烷化剂双功能基团的作用,与细胞内的亲核基团结合,主要与DNA链上的碱基作用,与碱基结合形成三种形式的交联,改变其作为正常复制模板的功能,造成DNA的损伤,破坏DNA的复制,诱导细胞的凋亡,阻断细胞周期的G2期,它还可以间接促进机体免疫而产生细胞毒作用[5]。

本实验研究表明:采用RT-PCR法和western blot法杂交出的特异性条带的灰度值高低来判断不同化疗药物作用不同时间对结直肠癌细胞株SW1116中DCC基因的影响。从基因转录水平和蛋白水平观察:顺铂和 5-氟尿嘧啶作用结直肠癌细胞株SW1116,可以促进DCC基因的转录和蛋白表达,并且在6小时DCC蛋白开始上调,12小时更加明显,表达量最高,细胞生长明显减慢,24小时达低值。结果表明DCC基因表达水平降低或缺失在结直肠癌的发生发展及转移过程中可能起了重要的作用,尤其对大肠癌细胞转移浸润过程的影响更为明显,说明常用化疗药物可通过使癌细胞表达DCC量的上升来实现其抗癌作用。成为大肠癌基因治疗的一个有效靶基因。

[1]Kim TH,Lee H K,Seo IA,et al.Netrin induces down regulation of its receptor,Deleted in Colorectal Cancer,through the ubiquitin proteasome pathway in the embryonic cortical neuron[J].J Neurochem JT Journal of neurochemistry,2005,95(1):1.

[2]龙陈艳,唐卫中.DCC基因与结直肠癌的研究进展[J].结直肠肛门外科,2009,15(6):431.

[3]Sarah Derks,Linda J.W.Bosch et al.Promoter CpG island hyper methylation and H3K9me3 and H3K27me3-mediated epigenetic silencing targets the deleted in colon cancer(DCC)gene in colorectal carcinogenesis without affecting neighboring genes on chromosomal region 18q21[J].Carcinogenesis,2009,30(6)1041.

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