胆囊腺癌pAKT、VEGF、微血管和微淋巴生成的检测及其临床意义

王甘露,姜汉国,黄 婷,贺 德,侍立志,陈 晖

(1.深圳市宝安区人民医院 外一科,广东深圳518101;2.广东医学院病理教研室,广东湛江524023)

近二十多年分子生物学的研究表明肿瘤的发生发展与肿瘤细胞的跨膜信息传递机制密切相关。目前,许多学者发现PI3K/AKT(磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸激酶)信号传导通路异常改变与人类一些恶性肿瘤发生发展密切相关[1-5]。胆囊腺癌是较少见的一类恶性肿瘤,多见于60岁以上的女性,早期诊断困难;一旦临床确诊,绝大多数已发生浸润和转移,预后差。有关胆囊腺癌转移的机制目前尚不清楚,为探索PI3K/AKT信号传导通路异常是否与其发生发展相关,本研究应用免疫组化法检测临床46例胆囊腺癌组织中pAKT、VEGF的表达及其微血管密度(MVD)和微淋巴管密度(MLD),旨在探讨它们对胆囊腺癌发生发展的影响。

1 资料与方法

1.1 标本来源 选取复旦大学附属中山医院和广东医学院附属医院2003年1月至2008年12月资料完整的46例胆囊腺癌根治术标本,患者术前均未经过任何抗肿瘤治疗。46例中男11例,女35例,中位年龄62岁;有淋巴结转移17例,无淋巴结转移29例。另选取胆囊腺瘤和慢性胆囊炎各10例作为对照组。全部标本经10%中性甲醛液固定,石蜡包埋,5 μ m厚连续切片待测。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 常规HE染色,胆囊腺癌分别按WHO分型及有无淋巴结转移进行分组。

1.2.2 免疫组织化学染色 免疫组化按SP试剂盒说明书步骤操作。由试剂公司提供的乳腺癌pAKT和VEGF阳性切片为阳性对照,PBS代替1抗作为空白对照。抗CD34、CD31和D2-40单克隆抗体及免疫组织化学试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司,pAKT(S473)和VEGF多克隆抗体购自Cell Signaling公司。分别应用抗血管内皮CD31和CD34单克隆抗体双标和D2-40单克隆抗体来检测胆囊腺癌组织中的MVD和MLD。

1.3 结果判断 pAKT、VEGF、CD34、CD31 和 D2-40定位于细胞质,细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。阳性细胞＞10%为阳性表达。MVD和MLD按文献[6,7]计数,即在低倍镜下选择癌灶周围间质血管密集区,用400×高倍视野内计数4个不同区域的微血管和微淋巴管,取其平均值为微血管和微淋巴管密度。

1.4 统计学方法 实验数据统计采用统计学软件SPSS13.0。根据资料类型和统计目的不同分别做四格表 χ2检验,Spearman相关分析,独立样本t检验。P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 pAKT和VEGF在胆囊炎、胆囊腺瘤和胆囊腺癌组织中的表达 在10例胆囊炎和胆囊腺瘤组织中,pAKT和VEGF阳性表达率分别为20.0%(2/10)、40.0%(4/10)和40.0%(4/10)、60.0%(6/10)。在慢性胆囊炎,pAKT阳性细胞主要呈灶性分布于胆囊黏膜腺体,腺体之间的间质散在的阳性;VEGF阳性细胞除胆囊黏膜腺体外,腺体之间的间质和血管也可见散在的阳性(图1)。在胆囊腺瘤,pAKT和VEGF阳性细胞表达范围和强度明显增加(图2)。46例胆囊腺癌pAKT和VEGF的阳性表达率分别为87.0%(40/46)和91.3%(42/46)。胆囊腺癌pAKT和VEGF阳性细胞弥漫并多聚集成团(图3,4)。从整体看,胆囊炎和胆囊腺瘤组织中pAKT和VEGF阳性反应强度和范围较癌组织明显减弱。胆囊炎、胆囊腺瘤和胆囊腺癌中pAKT和VEGF的阳性表达率有非常显著性差异(P＜0.01),见表1。

2.2 pAKT、VEGF表达与胆囊腺癌临床病理参数及微血管和微淋巴管密度关系 pAKT的阳性表达与临床分期和淋巴结有无转移显著相关,统计学有显著性差异(P＜0.05)。MVD与肿瘤生长方式和临床分期显著相关(P＜0.05;P＜0.01);MLD与肿瘤生长方式和淋巴结有无转移有非常显著差异(P＜0.01)见表2。肿瘤组织中的微血管在肿瘤中央区及周边区均均匀分布,并呈不同程度的扩张状态,尤其在浸润癌组织周围微血管较多(图5)。肿瘤组织中淋巴管主要分布在肿瘤边缘区,该区淋巴管分布较为密集呈不同程度的扩张状态,甚至可见淋巴管内的瘤栓,而肿瘤中心区淋巴管分布较稀疏,多呈条索状,甚至是残缺状态或未见有淋巴管分布(图6)。

表1 pAKT和VEGF在胆囊腺癌旁组织及胆囊腺癌中的表达(例,%)

表2 pAKT、VEGF表达与胆囊腺癌临床病理参数及微血管、微淋巴管的关系

2.3 胆囊腺癌组织pAKT、VEGF阳性表达与MVD和MLD的相关性 40例pAKT阳性组的MVD为29.6±5.4,阴性组MVD为 23.5±4.2,阳性组的MVD明显高于阴性组;42例VEGF阳性组的MVD为29.5±5.2,4例阴性组MVD为22.3±3.6,两组的MVD之间有显著性差异,Spearman相关分析表明胆囊腺癌的pAKT和VEGF表达与MVD呈正相关。pAKT阳性组的MLD为8.0±2.4阴性组MLD为4.6±1.9,阳性组的MVD明显高于阴性组;42例VEGF阳性组的MLD为7.9±2.5,4例阴性组MVD为7.8±2.9,两组的MLD之间无显著性差异,Spearman相关分析表明胆囊腺癌的pAKT表达与MLD呈正相关,见表 3。

表3 pAKT、VEGF表达与胆囊腺癌微血管及微淋巴管的相关分析(Spearman相关分析)

图1 慢性胆囊腺炎组织pAKT阳性表达,SP×100

图2 慢性胆囊腺炎组织pAKT阳性表达,SP×100

图3 胆囊腺癌组织pAKT呈阳性表达,SP×200

图4 胆囊腺癌组织VEGF呈阳性表达,SP×200

图5 胆囊腺癌组织微血管密度,SP×100

图6 胆囊腺癌组织微淋巴管密度,SP×100

3 讨论

本实验中,免疫组化的结果表明,胆囊腺癌pAKT、VEGF阳性表达率明显高于慢性胆囊炎和胆囊腺瘤,它们之间的阳性表达率有非常显著性差异(P＜0.01)。pAKT的阳性表达与临床分期和淋巴结转移显著相关,统计学有显著性差异(P＜0.05)。MVD与肿瘤生长方式和临床分期显著相关;MLD与肿瘤生长方式和淋巴结转移有非常显著差异(P＜0.01)。pAKT和VEGF阳性组的MVD明显高于其阴性组,Spearman相关分析表明胆囊腺癌的pAKT和VEGF表达与MVD呈正相关。pAKT阳性组的MLD的MVD明显高于阴性组,Spearman相关分析表明胆囊腺癌的pAKT表达与MLD呈正相关,而VEGF阳性组的MLD与阴性组之间无显著性差异。这些结果揭示pAKT、VEGF和胆囊腺癌的发生发展密切相关。到目前为止,pAKT促进肿瘤发生发展的机制并不完全清楚,现在的研究提示可能是通过促进肿瘤组织中血管和淋巴管的新生而影响[8,9]。众所周知,肿瘤的发生发展和转移依赖于新生血管和淋巴管的形成,从本实验结果分析,pAKT主要通过VEGF影响了胆囊腺癌的微血管和微淋巴管的生成。现有的研究结果表明,主要是在血管生成因子VEGF和PDGF的作用下,肿瘤细胞通过EGF(epidermal growth factor,表皮生长因子)/PI3K/AKT/FRAP通路促进肿瘤血管和微淋巴管形成和生长。也有学者提出pAKT可通过其它途径影响胆囊腺癌的发生、微血管和微淋巴管生成和转移[10,11]。我们的结果提示MLD在胆囊腺癌的转移中的作用密切相关,而MVD可能与肿瘤的生长关系更为密切。

综上所述,PI3K/AKT信号传导通路参与了胆囊腺癌的发生发展,其中pAKT可能通过调节VEGF而影响胆囊腺癌新生血管和微淋巴管的形成,从而与其转移密切相关,这提示阻断PI3K/AKT信号传导通路将对胆囊腺癌的治疗提供新的靶点。

[1]周晓东,于皆平,于红刚,等.蛋白激酶B在胃癌中的表达及其生物学意义[J].中华消化杂志,2005,25(7):401.

[2]Yamamoto K,Tomita Y,Hoshida J,et al.Prognostic significance of activated AKT expression in pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Clin Cancer Res,2004,10(8):2846.

[3]Grabacka M,Plonka PM,Urbanska K,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activation decreases metastatic potential of melanoma cells in vitro via down-regulation of Akt[J].Clin Cancer Res.2006,12(10):3028.

[4]0ka N,Tanimoto S,Taue R,et al.Role of phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in bladder cancer cell apoptosis induced by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand[J].Cancer Sci,2006,97(10):1093.

[5]Shinohara M,Chung YJ,Saji M,et al.AKT in thyroid tumorigenesis and progression[J].Endocrinology 2007,148(3):942.

[6]Kajiya K,Hirakawa S,Ma B,et al.Hepatocyte growth factor promotes lymphatic vessel formation and function[J].EMBO J,2005,24(16):2885.

[7]Jiang WG,Davies G,Martin TA,et al.The Potential lymphangiogenic effects of hepatocyte growth factor/scatter factor invitro and in vivo[J].Int J Mol Med,2005,16(4):723.

[8]Kobayashi I,Semba S,Matsuda Y,et al.Significance of Akt phosphorylation on tumor growth and vascular endothelial growth factor expression in human gastric carcinoma[J].Pathobiology 2006,73(1):8.

[9]Hu L,Hofmann J,Jaffe RB.Phosphatidylinositol 3-kinase mediates angiogenesis and vascular permeability associated with ovarian carcinoma[J].Clin Cancer Res 2005,11(22):8208.

[10]Agarwal A,Das K,LernerN,Sathe S,et al.The AKT/I?B kinase pathway promotes angiogenic/metastatic gene expression in colorectal cancer by activating nuclear factor-κ B and β-catenin[J].oncogene,2005,24(6):1021.

[11]Korner A,Mudduluru G,Manegold C,et al.Enzastaurin inhibits invasion and metastasis in lung cancer by diverse molecules.[J].Br J Cancer,2010;103(6):802.