热水法抽提鳕鱼皮胶原蛋白条件的响应面分析

赵 睿， 王 晓 丹， 祖 国 仁， 赵 长 新

( 大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

胶原蛋白是动物体最重要的蛋白质之一，是结缔组织极重要的结构蛋白质[1]。我国在水产市场上存在大量鳕鱼皮，而鳕鱼皮中存在大量的胶原蛋白。关于鳕鱼皮中胶原蛋白的提取方法在之前的研究中未见报道，如果能从这些废弃的鳕鱼皮中提取胶原蛋白加以利用，可减少环境污染，获得更安全的胶原蛋白[2]。

在以往的研究中，胶原蛋白的提取方法主要是酸提取法和酶提取法[3]。但酸法对胶原的损伤严重，难以获得较高质量的产品；而酶法引入外源蛋白，会对胶原蛋白的提纯造成影响。本文采用过程简单、便于操作的热水抽提法[4]，以鳕鱼加工的废弃物鱼皮作为研究材料，考查不同的水解温度、pH及水解时间对胶原蛋白提取率的影响，为我国水产品加工业的下脚料以及皮革行业产生的大量废弃物的利用和开发提供了绿色化工的有效途径，找出了较为经济的水解方法。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

鳕鱼皮，购于大连市场；正己烷、0.2%NaOH溶液、0.2%硫酸、柠檬酸、pH试纸、硝酸银溶液等试剂均为市售分析纯。

1.2 仪 器

JM-250小型电泳仪，大连捷迈科贸有限公司；KDN-05A蛋白质测定仪，上海贝特仪电设备厂；GTL-16A高速离心机，上海浦东物理光学仪器厂。

1.3 方 法

1.3.1 胶原蛋白的提取

1.3.1.1 鱼皮的预处理

将鱼皮去除鱼鳞鱼肉，洗净风干后，剪成0.5 cm×0.5 cm的小块，放入冰箱备用。

去脂肪：鱼皮中加入其质量30倍的20%的正己烷溶液(料液比1∶30)，加入表面活性剂于4 ℃下搅拌浸泡24 h，然后用蒸馏水反复清洗。

去杂蛋白：用0.2%的NaOH浸泡鱼皮40 min，搅拌，去离子水清洗至pH为中性；然后用0.2%的硫酸浸泡鱼皮40 min，搅拌，去离子水清洗至pH为中性；最后用1%的柠檬酸浸泡鱼皮40 min，搅拌，去离子水清洗至pH为中性。

1.3.1.2 热水法提取胶原蛋白

将2 g左右的鱼皮放入烧杯中，按料液比为1∶100加入去离子水，设置温度，用磁力搅拌器边搅拌边加热保温。随着时间的延长，鱼皮中的胶原蛋白，慢慢变性溶出。

1.3.2 鱼皮水解液中胶原蛋白质量分数的计算

用考马斯亮蓝的方法，使用可见光分光光度计测定样品中的蛋白质量分数。根据测出的蛋白质量和煮出溶液的体积计算胶原蛋白中蛋白质的质量分数，再根据所用鱼皮中蛋白质的总质量分数计算出胶原蛋白的得率。

1.3.3 鱼皮可溶性胶原的SDS-PAGE电泳测定

采用LaemmLi[5]的方法，用8%的分离胶和5%的浓缩胶，样品上样量为30 μL。电极缓冲液为0.05 mol/L的Tris-Gly缓冲液。

1.3.4 提取液中羟脯氨酸含量的测定

1.3.4.1 羟脯氨酸标准曲线的绘制

根据测得的不同质量浓度羟脯氨酸的OD值，绘制标准曲线。

图1 羟脯氨酸标准曲线图

1.3.4.2 样品中胶原蛋白质量分数的计算

X=a×11.1/m

式中，X为样品中胶原蛋白的质量分数，mg/g；a为测定液中羟脯氨酸的质量浓度，mg/mL；m为称取样品的质量，g；11.1为胶原蛋白水解为羟脯氨酸的系数。

2 结果与分析

2.1 胶原蛋白的提取

2.1.1 pH对胶原蛋白提取率的影响

将经过预处理后的鱼皮按1∶100加入去离子水，放在磁力搅拌器上进行加热保温并搅拌。由图2可以看出胶原蛋白的提取率在pH为2～4时提取率均较低，而在pH 5左右达到最大。

图2 pH对胶原蛋白提取率的影响

2.1.2 温度对胶原蛋白提取率的影响

从图3中可看出，30～40 ℃时鱼皮的蛋白提取率逐渐增高，40～60 ℃时的提取率逐渐下降。温度在从30 ℃升高到40 ℃的过程中，胶原蛋白的水解速度加快，但当温度过高时，胶原蛋白肽链的断裂也急速加剧，产生大量的肽链片段，胶原蛋白的提取率也随之下降。

图3 温度对胶原蛋白提取率的影响

2.1.3 提取时间对胶原蛋白提取率的影响

由图4可以看出，提取时间在12～24 h时，胶原蛋白的提取率逐渐提高，24～36 h时提取率基本平稳，在36 h之后胶原蛋白的提取率有所下降，可能是由于水解时间过长，破坏了胶原肽链，所以提取率反而下降。

图4 提取时间对胶原蛋白提取率的影响

2.2 响应面法优化实验条件

选取溶液pH(X1)、抽提温度(X2)和抽提时间(X3)作为考察因素，胶原蛋白的提取率作为指标。数据如表1所示。水抽提过程中pH、温度和时间之间相互作用对指标值的影响采用响应面图分析，结果如图5所示。当自变量逐渐接近中心点时，胶原蛋白的提取率逐渐提高。3个因素对提取率影响关系为X3>X2>X1，即时间(X3)对胶原蛋白提取率的影响较大。

表1 pH、温度、时间的编码处理

图5 pH(X1)、温度(X2)和抽提时间(X3)对胶原蛋白提取率的影响

y=-9.043 10E-04X1+0.106 715X2+

0.085 656X3-0.293 958X12-

0.342 179X22-0.349 687X32-

0.035 450X1X2+0.063 791 4X1X3+

0.085 029 3X2X3+0.840 337

解得X1=0.003 546，X2=0.173 6，X3=0.143 9。计算得胶原蛋白提取最佳工艺为温度41.74 ℃(取42 ℃)、pH 5.0、抽提时间25.72 h，将X1、X2、X3带入方程解得y值为85.86%，在此实验条件下测得胶原蛋白的实际提取率为83.75%，与理论值相差不大。

2.3 鳕鱼皮胶原蛋白的分子质量分布

胶原蛋白包括Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等。其中Ⅰ型由两条相同的α1(Ⅰ)和一条不同的α2(Ⅰ)肽链构成，即[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)。采用SDS-PAGE观察胶原蛋白分子中α链的分布，如图6所示。

A、B，样品；C，标准品

鳕鱼皮的水解液中至少含有两条不同的α链(α1和α2)及其聚合链，分子质量都在100 ku以上。条带α1内可能含有α3，但在SDS-PAGE上无法辨别。α1和α2两个不同亚基的存在证实了鳕鱼皮中胶原蛋白主要是Ⅰ型胶原蛋白。

3 结 论

经过响应面法优化之后得出了胶原蛋白提取的最佳工艺条件为pH 5.0、温度42 ℃、提取时间25.72 h。最优条件下胶原蛋白的提取率为83.75%，鳕鱼皮中的胶原蛋白主要为Ⅰ型。

[1] 史京京,陈丽娟,王颖,等. 胶冻强度与明胶α组份关系的研究[J]. 感光科学与光化学, 2002, 20(6):462-467.

[2] NOMURA Y, SAKAI H, ISHII Y, et a1. Preparation and some properties of type I collagen from fish scales[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1996, 60:2092-2094.

[3] 刘晓宁，刘安军，曹东旭，等.鱼鳞胶原蛋白的提取鉴定初探[J].食品研究与开发， 2007, 28(1):56-60 .

[4] 林家福，谢福美，易美华，等.热水提取罗非鱼鱼皮胶原蛋白的研究[J].中国热带医学， 2008, 8(8):1317-1318,1328。

[5] 李建武,萧能庚,余瑞元,等. 生物化学实验原理和方法[M]. 北京:北京大学出版社, 1997:165-266.