五倍子醇提物的抗氧化活性

勾 明 玥， 刘 梁， 张 春 枝

( 大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

五倍子始载于《开宝本草》，具有敛肺降火、涩肠止泻、固精缩尿、止汗、止血、解毒、敛疮、收脱肛及子肠坠下等多种临床功效[1-2]。五倍子中鞣质以及没食子酸等成分具有较多邻位酚羟基的结构，通过作为氢供体释放出氢与环境中的自由基结合，终止自由基引发的连锁反应，从而阻止氧化过程的继续传递和进行，因此在生物体内具有较强的清除自由基的作用， 从而产生抗衰老的作用[3]。同时由于自由基被清除，对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护，维护细胞膜的流动和蛋白质的构象，防止辐射诱发的DNA断裂，从而又具有抑制脂质过氧化、心血管病、抗突变、抗癌、抗白内障等方面的独特作用[4-5]。李怀荆等[6]研究了五倍子水煎剂对老鼠抗衰老作用。傅乃武等[7]报道了五倍子鞣酸抑制体内亚硝胺生成和对抗活性氧的作用。对五倍子的研究报道较多,但其抗氧化活性方面的研究尚未见文献报道。本文对五倍子乙醇提取物的还原能力、清除DPPH自由基能力、清除超氧阴离子能力、清除羟自由基能力及抗脂质过氧化作用进行了研究，并与VC或VE进行比较，从而评价其抗氧化活性，为五倍子的综合开发利用提供理论依据。

1 实 验

1.1 原 料

五倍子,市售。

试剂：DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基)，Sigma公司；VE，Sigma公司；VC、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、邻苯三酚、六氰合铁酸钾、亚甲基蓝、乙二胺四乙酸二钠、氯化亚铁、三氯化铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠,硫代硫酸钠、可溶性淀粉，均为分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 提取物的制备

称取五倍子5 g，粉碎后加80%乙醇75 mL，50 ℃超声波振荡提取30 min，取出上清液；再加入80%乙醇75 mL超声波振荡提取30 min，去药渣。两次提取药液合并，离心，旋转蒸发，干燥得五倍子提取物固体，提取率为51.8%。测定时用20%乙醇溶液将固体溶解并稀释到相应浓度。

1.2.2 还原力的测定

采用普鲁士蓝法，取1 mL样品溶液，加pH 6.6的磷酸缓冲液2.5 mL和质量分数1%铁氰化钾[K3Fe(CN)6]溶液2.5 mL，混合后在50 ℃放置20 min，加入质量分数10%三氯乙酸溶液2.5 mL混合，取混合液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和质量分数0.1% 氯化铁2.5 mL，混匀，静置10 min，在700 nm处测定吸光度[8]。

1.2.3 清除DPPH自由基能力的测定

取1 mL样品溶液，加入0.25 mmol/L DPPH ·的甲醇溶液，放入37 ℃水浴中反应20 min，在514 nm测吸光度，另设不加DPPH ·溶液的空白管及不加样品的控制管[9]。样品对DPPH ·的清除能力(scavenging activity，SA)可表示为

SA=1-(Ai-Aj)/A0

(1)

式(1)中，Ai为加抗氧化剂后DPPH溶液的吸光度，A0为末加抗氧化剂时DPPH溶液的吸光度，Aj为浸提液在测定波长的吸光度[10]。清除能力越高，抗氧化活性越高。

采用邻苯三酚法，取pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液4.5 mL，蒸馏水4.2 mL，混匀后加入30 mmol/L邻苯三酚0.3 mL，总体积为9.0 mL，空白管用Tris-HCl溶液作参比，测得A空。另取试剂，在加入邻苯三酚前加入不同浓度的样品溶液2 mL，蒸馏水减少相应体积，空白管用同样浓度的样品作参比，测得A样。测反应5 min时的吸光度值，清除率按式(2)计算[11-12]：

D=(A空-A样)/A空

(2)

1.2.5 清除羟自由基(OH ·)能力的测定

D=(AS-A0)/(A-A0)

(3)

1.2.6 过氧化值POV法

称取碘1.3 g及碘化钾3.5 g溶于10 mL水中，稀释至100 mL，摇匀，贮存于棕色瓶中，即为碘液。准确量取碘液20～25 mL，加水50 mL，0.1 mol/mL盐酸30 mL，摇匀，用0.1 mol/L Na2S2O3的标准溶液滴定近终点(微黄色)时加0.5%淀粉指示剂30 mL，继续滴定至终点(蓝色消失)。取碘液21.0 mL，滴定至终点时消耗Na2S2O3的标准溶液22.6 mL。由2Na2S2O3+I2→2NaI+Na2S4O6计算出碘液浓度：22.6×0.1×2/21.0=0.215 2 mol/L。

(1)工作曲线。按文献[15]方法得工作曲线方程为y=0.002 6x+0.008，R2=1。根据测得的吸光度值，通过查找工作曲线，可确定最终以I2在样品中的质量分数表示的样品的POV值。

(2)样品测定。未培育油样：取油样0.05 g于50 mL容量瓶中，加入氯仿-冰醋酸混合溶剂2.5 mL，加饱和KI溶液0.20 mL，轻轻摇匀，置于暗处反应5 min，取出后立即加水稀释(约40 mL)，加入10 g/L的淀粉溶液0.5 mL，用水稀释至刻度，摇匀，取上层清液于553 nm处以蒸馏水为参比测定其吸光度。

空白油样：取 95%乙醇溶液2 mL，加入6 mL植物油，混合后于60 ℃水浴2 h，剩余步骤同“未培育油样”。

添加样品的植物油样品：取五倍子提取物0.05 g，溶于10 mL 95%乙醇中，溶解后取2 mL加入6 mL植物油，混合后于60 ℃水浴2 h，剩余步骤同“未培育油样”。

(3)IR计算[16]。抗氧化性能可用比较直观的IR表示,与其抗氧化性能成正比。样品的POV值是指单位质量油样中碘的质量。计算公式为

IR=(A-B)/(A-C)

(4)

式(4)中，A为空白油样POV，B为添加样品油样POV，C为未培育油样POV。

2 结果与讨论

2.1 五倍子的还原力

以VC为阳性对照，五倍子提取物的还原力如图1所示。在700 nm测定的吸光值越大，则表明其还原能力越强。由图1可见，在所测浓度范围内，相同浓度的五倍子提取物和VC相比，提取物的还原能力强于VC，同时可以看出五倍子的还原能力随其浓度的增加而增强。由此可见，五倍子有很强的还原能力。

图1 五倍子提取物和VC还原力的比较

2.2 五倍子的清除DPPH自由基能力

以VC为阳性对照，清除DPPH自由基的能力结果如图2所示。由图2可知，在所测浓度范围内，相同浓度五倍子提取物的清除DPPH自由基能力略低于VC。当质量浓度为100 μg/mL时，五倍子提取物清除率达89.17%，略低于VC约10%。同时可以看出，随着五倍子提取物浓度的增加，清除能力增强。由此可见，五倍子提取物对DPPH自由基有较好的清除能力。

图2 五倍子提取物和VC的DPPH自由基清除能力的比较

2.3 五倍子的清除超氧阴离子能力

图3 五倍子提取物和VC超氧阴离子清除能力的比较

2.4 五倍子的清除羟自由基能力

以VC为阳性对照，测定其清除羟自由基(OH ·)的能力，结果如图4所示。由图4可知，在实验所测浓度范围内，相同浓度五倍子提取物的清除羟自由基能力略低于VC。当质量浓度为 20 μg/mL时，五倍子提取物的清除能力为27.78%，低于VC约30%。同时可以看出五倍子对羟自由基的清除能力随浓度的增加而增强。由此可见，五倍子提取物有较好的清除羟自由基能力。

图4 五倍子提取物和VC羟自由基清除能力的比较

2.5 五倍子的抗脂质过氧化作用

以VE为阳性对照，测定其抗脂质过氧化作用，结果如图5所示。由图5可知，在实验浓度范围内，相同浓度五倍子提取物的抗脂质过氧化作用略低(约10%)于VE。五倍子抗脂质过氧化作用随浓度的增加而增强。由此可见，五倍子提取物有较好的抗脂质过氧化作用。

图5 五倍子提取物和VE抗脂质过氧化作用的比较

3 结 论

采用5种方法评价了五倍子提取物的抗氧化活性。在所测浓度范围内，五倍子的抗氧化活性均随其浓度的增加而增强,同时五倍子提取物和VC(或VE)在同等浓度下，五倍子提取物的还原力和清除超氧阴离子的能力要高于VC，而清除DPPH自由基和羟自由基的能力低于VC，抗脂质过氧化的作用低于VE。实验结果表明，五倍子醇提物具有很高的抗氧化活性。

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