产β-内酰胺酶伤寒杆菌与痢疾杆菌bla TEM耐药基因研究

周东辉，黄丽琴，张淑华

（1．新钢中心医院，江西新余 338001；2.新余学院，江西新余 338004）

产β-内酰胺酶伤寒杆菌与痢疾杆菌bla TEM耐药基因研究

周东辉1，黄丽琴2，张淑华1

（1．新钢中心医院，江西新余 338001；2.新余学院，江西新余 338004）

目的:研究新余市产β-内酰胺酶伤寒杆菌与痢疾杆菌bla TEM-1D型耐药基因流行特征。方法:收集新余新钢中心医院、新余市人民医院、新余市中医院、新余市妇幼保健院2008年1月—2010年6月分离出的伤寒杆菌产酶株6株和痢疾杆菌产酶株13株共19株，用头孢哨噻吩滤纸片法做β-内酰胺酶的定性检测，确定为产酶株后，采用PCR技术扩增质粒bla TEM-1D耐药基因，用Mark标记量出扩增子的大小(bp)，统计bla TEM-1D耐药基因阳性率。结果:伤寒杆菌、痢疾杆菌产酶株bla TEM-1D耐药基因阳性率分别为66.7%（4/6）、76.9%（10/13）。结论:bla TEM-1D型耐药基因在本地区各家医院间存在水平传播和医院内垂直传播。

伤寒杆菌；痢疾杆菌；β-内酰胺酶；bla TEM-1D型耐药基因1

临床工作中β-内酰胺类抗生素的广泛应用导致了β-内酰胺酶的产生，成为肠杆菌科细菌耐药的主要机制。本次研究是调查新钢中心医院、新余市人民医院、新余市中医医院、新余市妇幼保健院2008年1月—2010年6月分离出的伤寒杆菌和痢疾杆菌产酶株bla TEM-1D型耐药基因的分布情况，报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集上述4家医院2008年1月—2010年6月分离出的伤寒杆菌和痢疾杆菌产酶株共19株（每一株至少对一种β-内酰胺类抗生素耐药）。确定为产酶株后，采用PCR技术扩增质粒bla TEM-1D耐药基因，用Mark标记量出扩增子的大小（bp）。

1.2 产酶株特殊耐药表型检测（β-内酰胺酶检测）采用头孢哨噻吩滤纸片法（nitrocefin test），用接种环挑取受试菌落于商品化头孢哨噻吩滤纸片上，于10min内由黄色转为红色即为阳性，示该受试菌产β-内酰胺酶，即为产酶株。

1.3 bla TEM-1D耐药基因检测

1.3.1 PCR引物及仪器 根据GenBank收录的质粒型TEM-1D基因序列及参考伍勇等〔1〕学者设计的引物，见表1。引物由上海生工生物工程公司合成。质粒小提取盒、PCR扩增试剂盒、2000 bpDNA Marker均为天根生化（北京）科技有限公司产品。PCR扩增仪为Perkin Elmer 9600。

表1 PCR所用的引物序列

1.3.2产酶株耐药质粒提起 对19株产酶株按质粒小提起盒说明书提起细菌质粒。以质粒作为PCR模板。

1.3.3 PCR扩增 以上述19株产酶株的质粒作为模板进行PCR，总反应体积为25μL：质粒模板1μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Mixter液12.5 μL，用去离子水补至25μL。PCR反应循环：94℃预变性3 min；94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min。

1.3.4 PCR产物分析 用1.5%的琼脂糖（含0.5μg/mLEB），1×TAE缓冲液中电泳，2~5 V/cm，凝胶成像系统照相，以2 000 bpDNA Marker（100，250，500，750，1 000，2 000 bp）为标准，分析电泳条带bp值。

2 结果

本组试验菌株的bla TEM型耐药基因经PCR扩增后的长度应为781 bp，在Mark条带上应是750 bp附近，故统计图1中的750 bp附近的条带分别是：痢疾杆菌10株，伤寒杆菌4株。

图1 bla TEM-1D型PCR产物电泳结果

3 讨论

痢疾杆菌与伤寒杆菌属于肠杆菌科细菌，而产β-内酰胺酶是肠杆菌科细菌对β-内酰胺类抗生素耐药最重要的机制之一。细菌产生的β-内酰胺酶通过它们的活性作用位点Ser-OH对β-内酰胺环上的羧基碳发生亲核攻击使环打开，形成通过脂键相连的酰酶复合物中间体，然后又能迅速水解酰酶中间体的脂键使酶再生，并释放β-内酰胺部分(已失活)，使细菌产生耐药性。目前国内外有许多关于β-内酰胺酶肠杆菌科细菌耐药性及耐药基因型的研究报道〔2-7〕。

有学者认为细菌对β内酰胺酶抗生素耐药主要是由质粒介导的β内酰胺酶所致,其中广谱青霉素酶（TEM）是最常见的质粒介导的酶,能使细菌对第一、第二代头孢菌素耐药。在院内感染病人中产生质粒介导酶的耐药菌，其产生耐药性大多是在接触抗生素后获得的，并通过耐药基因的转移而播散（水平传播），也可由基因表达而传至下代（垂直传播）。本次试验显示，本市4家医院之间均有相同的bla TEM型耐药基因阳性，而且同一家医院同一个科室在不同时期有相同的bla TEM型耐药基因阳性，提示bla TEM型耐药基因在本地区确实存在院内感染的水平传播和垂直传播。本次研究通过查阅临床相关病历资料发现痢疾杆菌与伤寒杆菌对氨苄西林的耐药率高达94.4%，故该药在本地区已不宜使用。第三代喹诺酮类抗生素耐药率低，可以首选。

PCR方法是肠杆菌科耐药菌中检测bla TEM的快速、有效的方法〔8〕。特别是在尚不知耐药基因流行病学情况的条件下，应用PCR方法可以快速筛查出肠杆菌科细菌的耐药基因型,大致了解其主要流行型别,为进一步研究提供依据。但是，本研究应用的PCR方法只是鉴定到基因型而并未鉴定到亚型，还需应用更多特异性的方法（如特异性引物的单一扩增、单链构象多态性PCR等技术）进行亚型鉴定。

〔1〕伍勇,徐令清,漆涌,等.大肠埃希菌质粒介导头孢菌素酶基因型研究〔J〕.临床检验杂志,2007,25（6）:407-409.

〔2〕虞春华,黄瑞．沙门菌属耐药机制的研究进展〔J〕.微生物学免疫学进展,2008,36（03）:38-39.

〔3〕邱雄泉,黄菊,潘晓丹,等．中山地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性调查〔J〕.中国医疗前沿,2008,3（14）:10-12．

〔4〕刘渠,许欣,李涌,等．沙门菌流行特点及耐药性分析〔J〕.中外健康文摘·医药学刊,2008,5（2）:21-31．

〔5〕蒋火刚,李树仁．遵义地区沙门菌、志贺菌的血清学分型及耐药性分析〔J〕.贵州医药,2007,31（6）:83-84.

〔6〕杨珊明．福氏志贺菌感染161例临床特点与耐药性分析〔J〕.中国实用内科杂志,2006,26（11）:865-866．

〔7〕张道平,何永贵,肖学慧,等.医院感染性标本细菌分离的变迁调查〔J〕.中华感染学杂志,2006,16（10）:1187-1188.对策的探讨〔J〕.中华医院感染学杂志,1999,9（4）:193-195.

〔8〕李虹玲,刘文恩,张运丽,等.应用多重PCR在肠杆菌科细菌中检测blaTEM、blaSHV、blaOXA-1基因〔J〕.中国感染控制杂志,2008,7（6）:377-380.

（责任编辑 蒋 康）

Study onβ-lactamase Producing Salmonella typhi and Shigella Resistance Gene of blaTEM

ZHOU Donghui1，HUANG Liqing2，ZHANG Shuhua1
（1.Xinyu Steel Central Hospital,Xinyu,Jiangxi338001,China;2.Xinyu University,Xinyu,Jiangxi338004,China）

Objective:To study epidemiological characteristics of the β-lactamase producing Salmonella typhi in Xinyu and Shigella blaTEM-1D-type resistance gene.Methods:Isolated enzyme production strains ofSalmonellatyphi6 and Shigella 13,a total of 19 strains were collected from the Xinyu Steel Central Hospital,People's Hospital of Xinyu,Chinese Medicine Hospital of Xinyu,Maternal and Child Health Hospital of Xinyu from January 2008 to June 2010.Cephalosporins post filter papermethod was used to do thiopheneβ-lactamase qualitative detection.Affter it was defined as enzyme production strains,the lift vector plasmid was amplified by PCR blaTEM-1D resistance gene.Mark was used tomeasure the amplification the size of sub （bp length）;blaTEM-1D resistance gene-positive rate was kept.Results:Enzyme production strains ofSalmonellatyphiand Shigella blaTEM-1D resistance gene positive rates were 66.7%（4/6）,76.9%（10/13）.Conclusion:BlaTEM-1D resistance gene hasmade vertical transmission and horizontal transmission in the local hospitals.

Salmonellatyphi;shigella;β-lactamase;blaTEM-1D resistance gene

R516.3

A

1672-2345（2011）02-0022-02

2010-12-15

周东辉，主治医师，主要从事临床检验研究.