猪伪狂犬病病毒的分离鉴定

杨庆芳，宁官保，李俊达

（1.晋中职业技术学院，山西晋中030600；2.山西农业大学，山西太谷030801；3.武乡县畜牧兽医中心，山西武乡046300）

2008年2月以来，山西多个规模化猪场出现妊娠母猪流产、木乃伊胎、死胎和产弱仔，初生仔猪出现神经症状，给生产造成巨大损失。为查明引起该疫病发生的根本原因，我们采集了病死猪的脑、肺、肝、脾、肾等组织病料，对其进行了研磨与过滤处理，并对其病原菌进行了分离。最终从病死仔猪的脑、肺、肝组织病料中分离出1株疑似伪狂犬病病毒（PRV）的毒株，并对其进行了系统的鉴定。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 细胞 仓鼠肾传代细胞（BHK-21），购于中国兽医药品监察所。

1.1.2 血清 猪伪狂犬病中和试验标准阳性血清，购于中国兽医药品监察所；阴性猪血清，采自规模猪场非免疫健康猪，经gE鉴别ELISA诊断试剂盒检测均为阴性。

1.1.3 病料 无菌采集病死仔猪、流产胎儿的脑、肺、肝、脾、肾等组织置-70℃保存，供分离病毒用。用前将上述组织混合在一起于灭菌过的研钵内剪碎，用组织研磨器研磨，加入含青霉素、链霉素（终浓度各1 000单位/mL）的Hank’s液制成1∶5乳剂，置15 mL的离心管中反复冻融3次，3 000 r/min离心30 min，取病料上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，-70℃保存作为接种材料。

1.1.4 试剂 （1）DMEM培养基，Gibco12100-046，购自华美生物工程公司；（2）新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品；（3）青霉素160万单位，链霉素100万单位，山东鲁抗医药股份有限公司产品；（4）Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL），4 dNTP 混合液（各 2.5 mmol/L），DL2 000 DNA Marker，天根生化科技（北京）有限公司产品；（5）胰酶，蛋白酶 K，EDTA，Tris液，SDS，琼脂糖，生工生物工程（上海）有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养

1.2.1.1 细胞复苏 从液氮中取出装有BHK-21细胞的冻存管，迅速放入37～40℃温水中，同时不断晃动，使冻存细胞尽快融化，在超净工作台中无菌打开冻存管，用吸管把冻存液缓慢加入放有10 mL无血清的DMEM离心管中，800 r/min离心10 min，吸去上清，用含10%血清DMEM悬浮细胞，加入细胞瓶中再加7 mL生长液，复苏。显微镜下观察细胞形态并检测细胞活力。置于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养，待生长正常后进行试验（一般在48 h左右长成单层）[1]。

1.2.1.2 细胞冻存 选取生长良好的细胞瓶，弃去培养液，加入1 mL左右的消化液（25 cm2细胞培养瓶），静置，待细胞之间出现小裂隙时，弃去消化液，加入3 mL无血清的DMEM培养基，用吸管吹打使细胞散开，吸15 mL到离心管中，800 r/min离心10 min，弃上清，用3 mL冻存液轻轻吹开细胞，移入冻存管中，缓慢冻存于4℃0.5 h，-20℃2 h，-80℃过夜，第2天放入液氮中冻存。

1.2.2 病毒的增殖 当BHK-21细胞铺满单层时，按10%的量接种处理好的病料，每份接种2瓶，并设2瓶正常为对照。37℃温箱中吸附2 h，期间每隔30 min晃动接种的培养瓶，使接种液和细胞充分接触。孵育2 h后，倾去接种液，加入8 mL含2%血清的维持液。置37℃，5%CO2培养箱培养，逐日观察细胞病变（2～3次/d），待细胞病变达80%时，收获病毒，-20℃保存备用。若第1次接种不出现细胞病变，则将细胞培养物反复冻融3次后，4℃，1 000 r/min离心10 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，盲传3代，有细胞病变者继续传代，直至第4代，收取细胞瓶，反复冻融3次，经3000r/min离心10min，收获上清液作为种毒于-70℃保存。

1.2.3 病毒的毒价测定 取种毒100 μL用维持液900 μL连续做10倍稀释，从10-4稀释到10-11，接种于长成单层的96孔培养板，每稀释度8孔，每孔100 μL，同时设2组细胞对照，37℃，5%CO2培养。连续观察5 d，记录结果，按Karber法计算毒株的TCID50。

1.2.4 病毒的鉴定

1.2.4.1 病毒的中和试验 采用固定病毒稀释血清法，将伪狂犬病病毒标准阳性血清用50 μL无血清的DMEM作倍比稀释，从20到29，分别与50 μL含200个TCID50的分离病毒液混匀，置37℃作用1.5 h，接种于长成单层的96孔培养板，每个稀释度8孔，每孔100 μL，并设阳性血清和正常细胞作为对照。5%CO2，37℃培养，连续观察5 d，按Reed-Muench法计算血清中和效价[2]。

1.2.4.2 病毒PCR鉴定

（1）引物的设计与合成。运用Primer premier 5.0软件，参考Genbank上已发表的PRV序列，针对PRV的保守序列设计1对引物，扩增片段为237 bp。上游引物：5′-CACGGAGGACGAGC TGGGGCT-3′，下游引物：5′-GTCCACGCCCC GCTTGAAGCT-3′。

引物由南京金思特科技有限公司合成。使用前，用高压灭菌超净水溶解，浓度20 pmol/μL，置于-20℃保存备用[3]。

（2）病毒核酸的提取。取病毒液SX09及阴性对照各500 μL，加入10%SDS、蛋白酶K至终浓度分别为0.5%和50 μg/mL，水浴2 h。用等体积的苯酚、苯酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提1次，取上清。向上清液中加入1/10体积的3 mol/L NaAc（pH值为5.2）和等体积的异丙醇，室温放置30 min，4 ℃ 13 000 r/min 离心 15 min，弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀，待干燥后，用30 μL灭菌水溶解DNA沉淀，-20℃保存备用。

（3）PCR 鉴定。反应体系：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，上下游引物各 10 pmoL，DNA模版 2.0 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，加 ddH2O至 25 μL。反应条件：95 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 45 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸7 min。PCR产物鉴定：取7 μL PCR产物，加2 μL 6×Loding buffer混匀后进行1%琼脂糖凝胶电泳。

2 结果与分析

2.1 细胞病变观察

病料SX09接种BHK-21细胞，盲传4代。36 h后，细胞开始收缩、变圆，聚拢（图1-A）。细胞层形成空洞状病变，至70 h可见成片脱落（图1-B）；对照细胞没有变化，正常（CK）（图 1-C）。

2.2 分离病毒的TCID50

对分离的PRV SX09毒株接种96孔细胞培养板进行毒价测定，进行3次重复试验。试验结果如表1所示。

表1 PRV病毒滴度的测定

将试验测得的数据代入Karber法计算公式lgTCID50＝L＋d（S－0.5）（其中，L 为最低稀释度的对数，为-4；d为稀释系数，10倍递进稀释时，d为-1；S为死亡比值之和，即各组感染数/试验数的相加）。根据此公式计算该病毒的TCID50分别为 10-8.0/0.1 mL，10-8.125/0.1 mL，10-8.0/0.1 mL，得平均值为10-8.042/0.1 mL。

2.3 中和试验

PRVSX09与标准阳性血清中和试验结果如表2所示。根据Reed-Muench法计算，病毒分离株的200个TCID50能被标准阳性血清10-1.93所中和，表明病毒分离株具有PRV的抗原性。

表2 PRV SX09与标准阳性血清中和试验

2.4 PCR鉴定产物电泳结果

用从SX09病毒液中提取的基因组DNA作为模板，进行PCR引物扩增，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，以DL2 000 DNA Marker为标准，扩增出的特异性片段，与预期的大小一致，模板PCR扩增产物大小近似237 bp（图2）。

3 讨论

据文献报道[4]，PRV可在多种动物细胞中生长繁殖，如在猪肾细胞、兔肾细胞、牛睾丸细胞等原代细胞以及PK-15，Vero，BHK-21等传代细胞中都能很好地增殖。本试验充分验证了PRV可在BHK-21细胞上增殖，并出现典型的疱疹病毒的细胞病变，毒价（TCID50）为 10-8.042/0.1 mL；病毒能被PRV标准阳性血清中和；用PCR方法鉴定分离的病毒液为PRV阳性；以上结果表明所分离的病毒株为伪狂犬病病毒。并命名为SX09株。

查阅文献发现，伪狂犬病病毒株间毒力存在差异[5]。在本试验中，以微量法测得分离病毒株在BHK-21细胞上的TCID50为10-8.042/0.1 mL，与国内其他分离毒株相比，病毒毒力较强。另外，分离病毒株能被PRV标准阳性血清中和，这与目前各国学者认为的PRV仅有一个血清型相吻合[6]。

在对SX09株进行TCID50测定时发现，病毒液在最大稀释倍数时，没有任何一孔发生细胞病变，而在最小稀释倍数时，8孔细胞全部出现细胞病变，说明该试验是成立的且试验结果可信；中和试验的过程中，血清在最小稀释倍数时，没有任何一孔发生细胞病变，而在最大稀释倍数时，8孔细胞全部出现细胞病变，说明该试验仍然是成立的且试验结果可信。

本试验首次对山西省猪伪狂犬病病毒进行了分离鉴定，填补了山西在此方面研究的空白，也为今后开展该病的诊断和防治研究奠定了基础。

［1］Maes R K，Sussman MD.Recent develop-ments in latency and recombination ofPRV[J].Vet Microbiol，1997，55：13-27．

［2］李学伍，陈焕春.PCR法对伪狂犬病病猪不同部位的检测及敏感性试验[J].中国畜禽传染病，1998，20（6）：365-368.

［3］陈陆，查光明，王川庆，等.伪狂犬病病毒gE/gB PCR鉴别方法的建立及其应用[J].中国兽医科技，2005，35（5）：346-348.

［4］方万荣，陈焕春，何启盖，等.应用微量中和试验进行猪伪狂犬病血清学调查[J].中国畜禽传染病，1998，20（3）：24-26.

［5］ Talmagc T B，Kwang O S，Frcdcrick J F.Dctcction of PR Viral DNAin tonsillar epithelial cells oflatecntiyinfected pigs[J].Am J Vet Res，1995，56（5）：587-594．

［6］Cheung A K.Investigation of PRV DNA and RNA in trigeminal ganglia tonsil tissues of latentlyinfected swine[J].AmJ Vet Res，1995，56（1）：45-50.