对1株肠膜明串珠菌生长曲线和世代时间的初步探讨

王 呈，梁茂文，赵瑞生，薛艳蓉，田 歌

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032）

肠膜明串珠菌具有优良的发酵特性，它能够发酵生成CO2和多种风味化合物[1]，可改善发酵乳制品的口味[2]，它的一些菌株可利用蔗糖生成葡聚糖，从而大大提高发酵乳制品的品质[3]。因而，在发酵乳制品中，它是占有重要地位的发酵剂菌种之一，并得到广泛应用。

肠膜明串珠菌属明串珠菌属（Leuconostoc），有乳脂亚种、葡聚糖亚种和肠膜亚种3个亚种[4]。

本试验选用可生成葡聚糖的肠膜明串珠菌肠膜亚种LA-07，并经长期在脱脂牛乳中培养驯化后，将其在新鲜脱脂牛乳和MRS肉汤培养基中分别培养，通过平板计数法来获取其不同培养时间的菌数，并绘制生长曲线和计算世代时间，为进一步开展肠膜明串珠菌在牛乳发酵制品中的应用研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌种

肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leu.mesenteroides subsp.mesenteroides）LA-07，由山西省农业科学院畜牧兽医研究所畜产品研究室保藏。

1.2 培养基和稀释液

1.2.1 脱脂牛乳培养基 采用山西省农业科学院畜牧兽医研究所养牛中心提供的新鲜无抗牛乳，经脱脂后，分装于用硅胶塞密封的三角瓶中，在115℃下灭菌15 min。

1.2.2 MRS肉汤培养基、MC培养基 其均为北京陆桥技术有限责任公司产品。

1.2.3 稀释液 0.1%蛋白胨，0.85%氯化钠，pH值为6.8～7.0，在115℃下灭菌15 min。

1.3 试验设备

生物洁净工作台：型号BCM-1300A，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司产品。隔水式电热恒温培养箱：型号PYX-DHS-400-BS-Ⅱ，上海贺德实验设备有限公司产品。不锈钢立式电热蒸汽消毒器：型号YM50，上海三申医疗器械有限公司产品。电热恒温鼓风干燥箱：型号101-1-S-Ⅱ，上海跃进医疗器械厂产品。电子天平：型号FA1104N，上海民桥精密科学仪器有限公司产品。多功能红外炉：型号MC-H21S011，广东美的生活电器制造有限公司产品。电动乳脂分离机：型号9ND50，青海农牧机械制造有限公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 菌种的活化 将LA-07接到MRS肉汤培养基中（接种量为2%），于（30±1）℃活化培养，活化3代后为计数培养菌种备用（使用时摇匀）。1.4.2 活菌计数 用移液枪吸取2 mL计数培养用菌种液，分别加到含100 mL脱脂牛乳培养基和MRS肉汤培养基的三角瓶中，置恒温培养箱中培养（30℃）；从培养0 h起，每隔2 h取菌液进行活菌计数，菌液取10-4～10-9稀释度各100 μL用灭菌的三角涂布棒涂布于MC培养基平板上，30℃培养48 h，计算活菌数（cfu/mL）。活菌计数方法及数据处理参照GB4789.35—2010[5]。

1.4.3 生长曲线制作和世代时间计算 以各培养时期活菌数的常用对数值为纵坐标、培养时间为横坐标，绘制生长曲线；取对数生长期中的一段，计算世代时间：G＝t lg2/（Mt-M0）[6]。式中，G为世代时间，t为培养时间，M0为开始时的活菌数对数值，Mt为经t时间培养后的活菌数对数值。

2 结果与分析

2.1 生长曲线的绘制

按1.4.2进行活菌计数，并计算其常用对数值，结果如表1所示。再由表1中的数据绘制出肠膜明串珠菌的对数生长曲线（图1）。

表1 各培养时期活菌数及其对数值随时间的变化趋势

由图1可知，在新鲜脱脂牛乳和MRS肉汤培养基中，肠膜明串珠菌LA-07的生长均满足对数生长曲线规律。由于生长基质不同，LA-07在新鲜脱脂牛乳培养基中生长延迟期较长，繁殖较慢。

2.2 添加趋势线和趋势线方程

2.2.1 新鲜脱脂牛乳培养基中LA-07生长趋势线和趋势线方程 对表1中LA-07在脱脂乳培养基生长的原始数据添加趋势线（图2），可获得趋势线方程为：y＝5×10-9x6－5×10-7x5＋1×10-6x4＋0.000 3x3－0.007 6x2＋0.049 9x＋7.367 1（R2＝0.997 8） （1）

由图2可知，LA-07在脱脂乳培养基生长的延迟期为18 h，18～32 h进入对数期，32～42 h进入稳定期，42 h以后进入衰亡期。

2.2.2 MRS肉汤培养基中LA-07生长趋势线和趋势线方程 对表1中LA-07在MRS肉汤培养基生长的原始数据添加趋势线（图3），可获趋势线方程：y＝－2×10-5x4＋0.000 7x3－0.000 4x2－0.005 7x＋7.426 4（R2＝0.995 6） （2）

从图3中可获得LA-07在MRS肉汤培养基生长的延迟期为8 h，8～22 h进入对数期，22～28 h进入稳定期，28 h以后进入衰亡期。

2.3 世代时间的计算

2.3.1 新鲜脱脂牛乳培养基中LA-07的世代时间的计算 在新鲜脱脂牛乳培养基中，LA-07生长对数期为 18～32 h，取 x1＝t1＝20 h，x2＝t2＝30 h，t＝t2－t1＝10 h ，将 t1，t2分别代入方程（1），得 y1＝M0＝8.045 1，y2＝Mt＝9.619 1，则世代时间 G乳＝1.912 h≈114.7 min。

2.3.2 MRS肉汤培养基中LA-07世代时间的计算 在MRS肉汤培养基中，LA-07生长对数期为 8～22 h，取 x1＝t1＝10 h，x2＝t2＝20 h，t＝t2－t1＝10 h，将 t1，t2分别代入方程（2），得 y1＝M0＝7.829 4，y2＝Mt＝9.712 4，则世代时间 GMRS＝1.598 h≈95.9 min。

3 结论与讨论

本试验针对同一个菌株，采用了同一菌种、相同的菌种活力、相同的接种量、相同的培养温度，研究其在2种不同培养基条件下的生长曲线和世代时间。结果表明，肠膜明串珠菌LA-07在MRS肉汤培养基中，生长周期短，在28 h后就进入衰亡期，而在新鲜脱脂牛乳培养基中则要42 h；肠膜明串珠菌LA-07在MRS肉汤培养基中的延迟期和稳定期分别为8，6 h，均要比其在新鲜脱脂牛乳培养基（18，10 h）中少，而肠膜明串珠菌LA-07在2种培养基中的对数期相同，都为14 h；肠膜明串珠菌LA-07在2个不同培养基中的世代时间分别为：G乳=114.7 min，GMRS=95.9 min。

通过在2种不同培养基中的生长周期、延迟期、世代时间对比，说明肠膜明串珠菌LA-07在MRS肉汤培养基中的生长优于其在新鲜脱脂牛乳培养基。

通过在2种不同培养基中的稳定期对比，说明在保持菌种活力方面，新鲜脱脂牛乳培养基要优于MRS肉汤培养基。

处于对数期的微生物，由于其代谢旺盛，生长迅速，个体形态和生理特性较一致。因而，其是发酵制品生产和科学研究的良好材料。为了较准确地划分微生物生长的各个时期，避免因个别试验数据的偏差而造成整体试验结论的偏移，本试验采用了添加趋势线的分析方法，不仅可较理想的划分微生物生长的不同时期，同时还能较精确的计算其世代时间。

对于肠膜明串珠菌LA-07在2种培养基中的对数生长期相同，是否有其一定的必然性，还有待于进一步研究。

［1］Hemme D，Foueaud C.Leuconosotc characteristics，use in dairy technology and prospects in functional food[J].Int Daiyr J，2004，14：467-494.

［2］ Vrdamuhtu E R.The Daiyr Leuconosotc：Ues in dairy products[J].J DairySci，1994，77：2725-2737.

［3］Duboc Molle B.Applications of exopolys accharides in the dairy industry[J].Int DairyJ，2011，11：759-768.

［4］凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999.

［5］Harrigan WF.食品微生物实验室手册[M].李卫华，方红，廉慧锋，等，译.北京：中国轻工业出版社，2004.

［6］武汉大学，复旦大学生物系微生物学教研室.微生物学[M].3版.北京：高等教育出版社，1989.