中国猕猴CD4+CD25+调节性 T细胞对Vγ2Vδ2 T细胞体外增殖的影响*

龚光明，秦 洁，轩小燕，杜 英，朱 沙，孙石磊，许予明

1)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室郑州450001 2)郑州大学第一附属医院神经内三科郑州450052

(2010-11-06收稿 责任编辑 王 曼)

自然发生的CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory T cells，Tregs)通过抑制或影响CD4+和CD8+T淋巴细胞等的激活、扩增和(或)功能，在维持外周耐受和免疫系统平衡过程中发挥关键作用。最近研究［1］表明，γδT细胞也是Tregs直接调节的对象，Tregs对 γδT细胞有负调节作用［2-3］。γδT细胞只占T细胞总数的1% ～10%，其抗原识别受体(T cell receptor，TCR)由γ链和δ链组成，功能极为复杂并具有极强的可塑性。联合应用磷酸化抗原与IL-2可诱导灵长类动物Vγ2Vδ2 T细胞大量特异性扩增，这些扩增的细胞具有细胞毒性，并能特异性下调CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的数量［4］。因此，将 Vγ2Vδ2 T细胞作为感染性疾病潜在的免疫治疗工具或靶点，对难治性尤其是耐药患者进行免疫治疗，具有极大的实际应用价值。灵长类非人动物因为具有和人类非常接近的生物学特征，成为研究人类感染性疾病的珍贵动物模型［4-5］。作者观察了中国猕猴的 Tregs对 Vγ2Vδ2 T细胞体外增殖的调节作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 9只雄性中国猕猴(Rhesus macaques，RH)由美国芝加哥伊利诺伊州立大学生物资源中心提供。其中3只是无潜伏感染的正常动物，另6只3个月内人工感染过卡介苗(BCG)。年龄3～6岁，体质量3.1～6.9 kg。动物饲养和实验方法均经该校动物关怀与使用委员会批准。

1.1.2 抗体和试剂 ①纯化鼠抗人CD28(CD28.2)、CD3(SP34)以及PE-Cy7和PB融合的CD3抗体(SP34-2)为BD Pharmingen公司产品，PB融合的鼠抗人CD4(OKT-4)、PE-Cy7融合的CD8(RPA-T8)、PE融合的CD25抗体(BC96)为eBioscience公司产品，纯化或FITC融合的TCR Vγ2抗体(7A5)、纯化或 FITC融合的TCR Vδ2抗体(15D)购自Endogen公司，APC/PE融合的山羊抗鼠 IgG单抗购自Biolegend公司。②CFSE细胞扩增试剂盒(C34554)购自Invitrogen/Molecular Probes公司，灵长类非人动物Tregs分离试剂盒(130-092-984)、Anti-mouse IgG磁珠、MACS MultiStand(130-042-303)、LD(130-042-901)和 MS(130-042-201)分离柱、MiniMACS(130-042-102)和MidiMACS(130-042-302)分离单位均为Miltenyi Biotec产品。重组人 IL-2(I7908)、PKH26红荧光细胞着色盒(MINI 26)为Sigma/Aldrich产品。③磷酸化抗原 HMBPP［(E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl diphosphate-HMBPP］由德国 Reichenberg Armin实验室提供。

1.2 实验细胞的获取及纯化 ①外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs):采用密度梯度离心法从15 mL EDTA抗凝的中国猕猴外周血液中分离PBMCs。②Tregs:从PBMCs中阴性分选 CD4+T细胞，再从CD4+T细胞中分选CD4+CD25+T细胞。每次分选的CD4+CD25+T细胞的纯度总是＞90%。具体分选方法参见试剂说明书。

1.3 Tregs对Vγ2Vδ2 T细胞增殖的影响 分离6只感染过BCG的中国猕猴的PBMCs，去除Tregs后以CFSE标记，以2×105/孔接种96孔板，分4组，分别加入1∶8、1∶4、1∶2和1∶1比例的 PKH26标记的Tregs;分别将HMBPP(终浓度150 nmol/L)、鼠抗人CD3和CD28单抗(终浓度5 mg/L，第0天加入)、IL-2(终浓度20 U/mL)加入相应孔中，于37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度下，以含体积分数10% 胎牛血清、50 U/mL青霉素和50 mg/L链霉素的RPMI 1640细胞培养液培养细胞。培养7 d后，收集细胞进行CD3、Vδ2荧光抗体染色，24 h内上流式细胞仪(美国 DakoCytomation公司)检测。用Summit V4.3(美国 DakoCytomation公司)分析CD4+T细胞的CFSE信号强度。分析时根据SSC/FSC和FSC/Pulse Width点阵对PBL设门，并排除掉PKH26+细胞的干扰。细胞扩增比例以CFSEdim细胞所占CFSE+细胞的百分比计算。

1.4 Tregs对IL-2联合 HMBPP 预激活的 Vγ2δ2 T细胞增殖的影响 分离3只正常中国猕猴的PBMCs，去除Tregs后以CFSE标记，以4×105/孔接种96孔板，每孔加入HMBPP(终浓度为150 nmol/L)和IL-2(终浓度20 U/mL)于37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度下培养，第3天半量换液1次并维持IL-2终浓度为20 U/mL。培养5 d后，收集细胞并标记CFSE，与当天新鲜分离的同一动物的Tregs混合，加入IL-2继续培养4 d。实验第9天收集细胞，进行CD3、CD4及 Vδ2荧光抗体染色，24 h内上流式细胞仪检测(同1.3)。

1.5 统计学处理 采用GraphPad软件，应用t’检验分析Tregs对HMBPP及CD3/CD28抗体诱导的Vγ2Vδ2 T细胞增殖的影响，应用单因素方差分析比较Tregs对IL-2联合 HMBPP诱导的 Vγ2Vδ2 T细胞增殖的影响，应用析因设计的方差分析比较Tregs对IL-2联合HMBPP预激活的Vγ2Vδ2细胞增殖的影响，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 Tregs对 Vγ2Vδ2 T细胞增殖的影响 见表1、2。Tregs不仅抑制 Vγ2Vδ2 T 细胞的 HMBPP 抗原特异性扩增以及CD3/CD28抗体诱导的抗原非特异性扩增，还剂量依赖性抑制IL-2联合HMBPP激活的Vγ2Vδ2 T细胞的扩增。

表1 Tregs对HMBPP及CD3/CD28抗体诱导的 Vγ2Vδ2 T细胞增殖的影响

表2 Tregs对IL-2联合HMBPP诱导的Vγ2Vδ2 T细胞增殖的影响 %

2.2 Tregs对 IL-2联合 HMBPP预激活的Vγ2Vδ2 T细胞增殖的影响 见表3。由表3可知，Tregs对IL-2联合HMBPP预先激活的Vγ2Vδ2 T细胞的继续扩增有抑制作用。

表3 Tregs对IL-2联合HMBPP预激活的Vγ2Vδ2 T细胞增殖的影响(n=3) %

3 讨论

已有较多的证据表明可利用Tregs作为免疫治疗的工具治疗肿瘤［6］、移植［7］和自身免疫病［8］，但其在病原性疾病中的应用较少。大量研究［9-12］证实Tregs可控制多种病原的进展，比如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、结核分枝杆菌及真菌等。IL-17是招募中性粒细胞移行到肺部的主要细胞因子。研究［13］表明，在肺结核感染的早期，作为IL-17的主要产生细胞，γδT细胞参与中性粒细胞介导的炎症反应，包括随后肉芽肿的形成。

该研究结果显示，中国猕猴Tregs对Vγ2Vδ2 T细胞有强大的体外抑制功能。Tregs不仅抑制CD3/CD28抗体诱导的抗原非特异性Vγ2Vδ2 T细胞的体外扩增，而且抑制HMBPP诱导的抗原特异性Vγ2Vδ2 T细胞的体外扩增。此外，Tregs以剂量依赖方式抑制IL-2联合HMBPP诱导的正在进行中的Vγ2Vδ2 T细胞的体外扩增，并抑制被 IL-2联合HMBPP预先诱导激活的 Vγ2Vδ2 T细胞的体外继续扩增。这些证据表明，Tregs控制Vγ2Vδ2 T细胞介导的抗结核免疫［1］，对正在进行中的广泛地抗结核感染免疫有强大的负性调节作用。Tregs可能被用来作为控制正在进行中的病原感染的特殊工具。已有报道［14］，使用 IL-2免疫毒素 Denileukin diftitox(一种IL-2和白喉毒素的融合蛋白)可以减少Tregs的数量，最终通过加强抗原特异性免疫反应增强疫苗介导的T细胞免疫。

总之，对Tregs对Vγ2Vδ2 T细胞负调节作用的了解有利于准确理解人类免疫系统清除各种病原或有害生物因子以维持免疫系统平衡的机制，以及应用激活的Tregs和Vγ2Vδ2 T细胞治疗感染、肿瘤或其他难治性疾病的相关机制。

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