脱乙酰壳聚糖-三氟乙酸对变异链球菌的体外抑菌效果

张元鑫，陈小冬

(大连大学附属口腔医院修复科，辽宁大连 116021)

脱乙酰壳聚糖-三氟乙酸对变异链球菌的体外抑菌效果

张元鑫，陈小冬

(大连大学附属口腔医院修复科，辽宁大连 116021)

［目的］探讨脱乙酰壳聚糖-三氟乙酸(CS-TFA)复合物对变异链球菌的抑菌效果。［方法］将CS-TFA与壳聚糖(CS)分别加入变异链球菌培养基，测定各自的最小抑菌浓度，以人工唾液作对照组。取96孔板，采用对倍稀释方法用TPY液体培养基配制实验溶液，观察三组溶液对变异链球菌的抑菌效果。［结果］CS-TFA与CS的最小抑菌浓度分别为1.0 g/L与1.5 g/L，CS-TFA抑菌效果要优于CS。［结论］CS-TFA对变异链球菌有一定的抑制作用。

脱乙酰壳聚糖-三氟乙酸;变异链球菌;抑菌

随着氟化物应用于防治龋病时间的延长和研究的不断深入，其使用显示出越来越明显的局限性。寻找安全、有效并且经济的防龋药物成为龋病防治研究中的新热点。壳聚糖(chitosan，CS)是甲壳素脱乙酰化的衍生物，是自然界中唯一的碱性多糖。独特的分子结构使其具有抑菌、抗肿瘤、增强免疫力、促进组织再生等功能，用于龋病、牙周病的预防和治疗，具有其它天然材料无法比拟的优势［1-3］。CS本身也有缺点，比如其水溶性较差，抑菌能力有限。因此，本实验采用将三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)与CS通过化学结合的方式合成含氟复合物脱乙酰壳聚糖-三氟乙酸(CS-TFA)，探讨体外实验中CS-TFA对变异链球菌的抑菌特性。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂

96孔细胞培养板(美国，COSTAR)，HTS7000Plus多孔板(紫外/荧光可见光)高效分析仪(美国PE公司)，去离子水(由Millipore纯化系统提供)，TPY液体/固体培养基，CS(摩尔质量为231 kg·mol/L，脱乙酰度90%，国药集团化学试剂有限公司提供)，TFA(天津塘沽邓中化工厂，分析纯)。

1.2 菌株及菌液制备

实验菌株为变异链球菌 (S.mutans)模式株ATCC25175;变异链球菌复苏后接种于TPY琼脂平板，37 ℃厌氧(80%N2，10%H2，10%CO2)培养 48 h，挑取单菌落划线接种于TPY琼脂平板，37℃厌氧培养48 h，挑取单菌落接种于30 mLTPY液体培养基，37℃厌氧培养24 h，收集菌悬液，3500 r/min离心8 min，倾去上清液，细菌沉淀用TPY液体培养基洗2次后重悬于TPY液体培养基中，混匀，在540 nm波长处测定其吸光度值(A540)，用TPY液体培养基调整菌悬液吸光度A540=0.33，备用。

1.3 溶液制备

实验组:CS-TFA和CS。将质量1 g的CS加入80 mL配制好的体积分数2%的盐酸溶液，搅拌使其充分溶解，往上述溶液中加入TFA(CS与TFA质量比 1∶1)，加入0.75 g EDC.HCl，搅拌 12 h 后加入 0.75 g EDC.HCl，继续搅拌 12 h 后，加入氢氧化钠溶液调节pH值至3.5，通过透析和旋干，将所得产品放入60℃烘箱内烘干，即得CS-TFA复合物。CS-TFA和CS样品溶于1%(V/V)酷酸溶液，室温下搅拌 2 h，调 pH 值为 6.0，0.22 μm 的滤膜过滤后-20℃保存。

阴性对照组:人工唾液。采用ISO/TR 10271标准配制人工唾液:氯化钙 0.4 g、氯化钾 0.4 g、二水氯化钙(CaCl2·2H2O)0.795 g、二水磷酸氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.78 g、二水硫化钠(Na2S·2H2O)0.005 g和尿素 1.0 g。去离子水稀释至1 000 mL，用氢氧化钙和硫酸调整pH值至6.0，测试温度(37±1)℃，消毒备用。

1.4 抗菌实验

人工唾液采用对倍稀释方法。用TPY液体培养基将药物配制成梯度浓度的实验药液，于37℃厌氧环境中培养48 h，取出肉眼观察各孔中细菌生长情况。通过离心(3500 r/min，离心8 min)，菌细胞用PBS缓冲液洗2次，PBS缓冲液重悬后，观察实验组对变异链球菌的抑菌作用。将挑取菌液后的96孔板置多孔板高效分析仪上，测定各孔液体635 nm波长处的吸光度值。将经离心、PBS洗菌和重悬的96孔板置多孔板高效分析仪上，在635 nm波长处测定各孔的吸光度值。△A=A测定-A阴性对照，根据测定的△A绘制折线图。

在扫描电镜下观察正常条件下及CS-TFA抑菌作用下变异链球菌的形态。

2 结 果

2.1 形态学观察

扫描电镜下观察正常条件下变异链球菌的形态呈串珠状球菌，见图1;CS-TFA对变异链球菌的抑菌圈清晰可见，见图2。

2.2 实验结果

实验发现，当CS浓度≥1.5 g/L时，抑制作用曲线低平，变异链球菌的生长受到抑制;当其浓度＜1.5 g/L时，随着CS浓度的降低，对细菌的抑制作用逐渐减弱，抑制作用曲线呈上升趋势，曲线的拐点在CS浓度为1.5 g/L处;当CS-TFA浓度≥1.0 g/L时，抑制作用曲线低平，变异链球菌的生长受到抑制;当CS-TFA浓度 ＜1.0 g/L时，随着 CS-TFA浓度的降低，对细菌的抑制作用逐渐减弱，抑制作用曲线呈上升趋势，曲线的拐点在CS-TFA浓度为1.0 g/L 处(表1，图3)。

表1 CS-TFA和CS在不同浓度下药液的吸光度值Tab 1 Absorbance values of liquid of CS-TFA and the CS at different concentrations

图3 两种药物对变异链球菌抑制作用的比较Fig 3 Comparison of two drugs inhibiting Streptococcus mutans

3 讨 论

壳聚糖(CS)又名甲壳胺，是海洋甲壳类生物、昆虫和其他无脊椎动物外壳中的甲壳素［B-(1-4)聚-2-乙酰胺基-D-葡糖］的脱乙酰化合物，不溶于水，但可溶于某些酸。CS作为一种天然多糖，来源方便，易提取，无毒性，无刺激性，不致敏，不与体液发生反应，可被机体的溶菌酶生物降解，故不存在任何生物学危害，有良好的生物相容性，是一种值得应用的生物性制剂，其特有的生物粘附性，有助于抵御唾液的冲刷和稀释，在龋病的预防和治疗方面，具有巨大的应用潜力［4］。

三氟乙酸(TFA)是一种含氟有机酸，它是许多有机化合物的良好溶剂，如与二硫化碳合用，可溶解蛋白质。它也是有机反应的优良溶剂，是重要的有机合成试剂，由它可以合成各种含氟化合物。本实验CS-TFA为CS和TFA通过化学结合的方式合成，该复合物弥补了CS在抑菌中的不足。

以往更多的研究集中于CS的防龋功能。结果显示，甲壳胺复合物对口腔致龋菌生长、粘附和代谢产酸均有明显的抑制，主要体现在干扰细菌代谢、抑制变形链球菌的粘附、发挥缓冲作用及调节菌斑pH等方面。CS可以有效抑制变形链球菌的生长代谢，并增强唾液缓冲能力，提高菌斑pH值。0.5%CS可抑制变链菌对毛细管的粘附，并促使附着于粘附板上的变链菌脱落。在产酸实验中，0.5%CS可减少培养液终末pH下降和乳酸生成量［5］。

本研究结果显示，CS对变异链球菌均有一定程度的抑制作用。随着浓度的增加，抑菌作用增强，在高浓度时能完全抑制细菌的生长。当浓度为1.5 g/L时，变异链球菌受到明显的抑制。CS-TFA对变异链球菌的抑菌作用规律与CS类似，而当CSTFA浓度为1.0 g/L时对变异链球菌的生长有完全的抑制作用。并且从实验结果来看，CS-TFA的抑菌效果要略优于CS。

CS-TFA复合物在抑菌作用中独特的优势，可能是未来一种非常有价值的抗龋药物。本次实验只是初步的研究，需要今后对其抑菌机制、菌斑粘附性以及长期防龋效果、临床观察等进一步研究。

:

［1］Saranya N，Moorthi A，Saravanan S，et al.Chitosan and its derivatives for gene delivery［J］.Int J Biol Macromol，2011，48(2):234 -238.

［2］Bowey K，Neufeld RJ.systemic and mucosal delivery of drugs within polymeric microparticles produced by spray drying［J］.Bio Drugs，2010，24(6):359 -377.

［3］Kang ML，Cho CS，Yoo HS.Application of chitosan microspheres for nasal delivery of vaccines［J］.Biotechnol Adv，2009，27(6):857 -865.

［4］No HK，Park NY，Lee SH，et al.Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights［J］.Int J Food Microbiol，2002，74(1 - 2):65 -67.

［5］陈薇，杨圣辉，果梅英.甲壳胺复合物影响变形链球菌生长、代谢的实验室研究［J］.现代口腔医学杂志，2004，18(5):392-395.

Inhibitory effect of chitosan-trifluoroacetic acid complexes on streptococcus mutans in vitro

ZHANG Yuan-xin，CHEN Xiao-dong
(Department of Prosthodontics，the Affiliated Stomatology Hospital of Dalian University，Dalian116021，China)

Abstract:［Objective］To explore the effect of chitosan-trifluoroacetic acid(CS-TFA)complex on streptococcus mutans.［Methods］CS - TFA and CS were added to mediu of streptococcus mutans to determine the minimum inhibitory concentration，the artificial saliva was used as the control group，and the experiments were diluted with TPY liquid medium for preparation of the solution.［Results］The minimum inhibitory concentration of CS - TFA and CS are 1.0 g/L and 1.5 g/L，and the antibacterial effect of CS-TFA is better than that of CS.［Conclusion］CS-TFA has inhibitory effect in streptococcus mutans.

Key words:trifluoroacetic acid-chitosan;chitosan;streptococcus mutans;antibacterial

R781.1

A

1671-7295(2011)05-0441-03

2011-05-20;

2011-08-26

张元鑫(1971-)，男，辽宁辽阳人，副教授。E-mail:yuanxinzhang2006@yahoo.com.cn

陈小冬，教授。E-mail:chenxd0111@sohu.com