混合拮抗菌防治葡萄白腐病培养基的优化

齐牧遥，赵 丹，王 芬，谢 云，陈五岭

（西北大学生命科学学院，陕西西安710069）

美国红提葡萄又名美国红提、晚红、大红球，是美国加州大学育成的优质葡萄新品种，晚熟[1-2]，它以个大、色艳、肉厚、味甜、质优、耐贮等优良性状而著称，深受广大人民群众的喜爱。但是，红提葡萄属欧亚品种，抗病性较差，不抗多种病害，在多雨的年份或栽植在温暖湿润的地区，其主要病害尤其是真菌性病害发生严重，病害一旦蔓延，对产量、品质、效益影响较大，造成许多果园减产甚至面临毁园的危险，因此，防治病害至关重要[3-4]。

目前，红提葡萄的主要病害为葡萄黑痘病、葡萄霜霉病、葡萄白腐病，防治措施主要为套袋或者化学防治，但其往往会带来人力成本过高、用药盲目、超浓度用药等问题[5-6]。由于生物防治技术具有安全、无污染、无残留等特点，越来越受到人们的广泛关注。葡萄白腐病又称腐烂病，全世界均有分布，它是红提葡萄主要的真菌性病害之一。该病常年发生，一般年份会造成减产15%～20%，在流行年份达到60%以上，是红提葡萄病害中造成损失最重、危害最大的一种病害[7-8]。Guetsky等[9]证实，不同的拮抗微生物具有不同的功能，混合使用比单独使用效果更好。

本试验选取红提葡萄真菌性病害中发生频率最高、范围最广、病害严重性最强的白腐病的拮抗菌作为研究对象，将实验室已有的2种拮抗菌混合培养，从而获得拮抗能力更强的混合拮抗菌液，并尝试优化培养基配方，提高混合菌液的拮抗能力，旨在为进一步配制复合生防菌肥、无公害防治葡萄白腐病打下基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 枯草芽孢杆菌PT2′（由西北大学生命科学学院实验室诱变得到，保存于4℃冰箱），QM34（由西北大学胡青平博士筛选并予以鉴定），葡萄白腐病病原指示菌（为西北大学生命科学学院实验室保藏菌种）。

1.1.2 培养基 摇瓶种子培养基（g/L）：蛋白胨10.0，葡萄糖 5.0，牛肉膏 5.0，NaCl5.0，MgSO4·7H2O 0.15，MnCl2·7H2O 0.01。

牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉膏 3.0，NaCl15.0，琼脂 20.0。

玉米粉液体培养基：糖化酶（2 000单位），α-淀粉酶（2 000 单位），玉米粉，KH2PO4，CO（NH2）2。

牛肉膏蛋白胨液体培养基（g/L）：牛肉膏3.0，蛋白胨 10.0，NaCl15.0。

以上培养基使用的试剂均为化学纯，调整pH值为7.0，121℃下灭菌30min。

1.1.3 仪器设备 超净台SW-CJ-1F，上海苏净实业有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-40BI，上海申安医疗器械厂；电热恒温干燥箱GZX-DH 400-BS-Ⅱ，上海跃进医疗器械厂；显微镜Eclipse E200，尼康公司；电子天平Sartorius BS210S，北京赛文利斯；培养箱MJ-160-Ⅱ，上海跃进医疗器械厂；分光光度仪UV-2401，PC。

1.2 试验方法

1.2.1 最佳发酵条件的确定

1.2.1.1 最佳培养基的选择 将菌种PT2′及QM34按照接种量各1%混合，分别接种于装有无菌牛肉膏蛋白胨培养基、无菌摇瓶种子培养基和无菌玉米粉液体培养基的锥形瓶中，做好标记。然后将3个锥形瓶置于30℃，200 r/min的摇床中振荡培养24 h。重复3次。

1.2.1.2 发酵培养基生物量测量 取1.2.1.1的3种发酵液各1mL，于5mL无菌水中稀释后，分别取1mL，在660 nm下测定吸光值，标记为A660，每种发酵液重复测定3次。以未接种的无菌培养基按照相同的取量作为空白对照。

1.2.1.3 发酵培养基抑菌能力的观察 于4℃，1 000 r/min离心10min得到1.2.1.1的3种发酵液的上清液，经过微孔滤膜过滤得到无菌发酵液，以葡萄白腐病致病真菌为拮抗对象，四点杯碟对峙法[8]做拮抗试验，每个平板试验重复3次，记录拮抗抑菌圈的大小。离心得到的3组发酵液试验互为对照。

1.2.2 工业发酵培养基的优化

通过查阅相关文献[10]，在试验确定的最佳培养基的基础上，加入低浓度的MnS，以观察混合拮抗菌发酵液A660值以及抑菌能力的变化。

1.2.2.1 最佳培养基的优化 用SPSS 19.0设计6因素3水平的正交表，随机产生18组试验（表1）。30℃培养24 h后测定A660值，然后取拮抗菌株发酵液做拮抗试验，6 d后观察抑菌圈的大小，重复3次。

表1 L18（36）正交设计 g/L

1.2.2.2 统计分析 采用SPSS 19.0进行正交试验表格设计及方差分析。

2 结果与分析

2.1 3种培养基摇床培养菌数变化

将PT2′与QM34混合分别接入无菌牛肉膏蛋白胨培养基、无菌摇瓶种子培养基和无菌玉米粉液体培养基中，记为N组、Z组和Y组。振荡培养24 h，测定A660值，记录发酵液中菌数变化的结果（表2）。

表2 3种培养基发酵液的A660值

从表2可以看出，经过液体摇床发酵，Y组的吸光度值A660明显高于Z组和N组，这说明在玉米粉液体培养基中，PT2′与QM34的混合发酵液含菌量最多。

以表2数据为基础，假设Y组培养基中，PT2′与QM34的混合发酵液含菌量最多为正确，经过SPSS数据分析，得到表3。

从表3可以看出，N，Z，Y这3组数据的P值均小于0.01，说明根据表2推理的假设成立，且Y组的A660较N组和Z组有显著差异，这说明Y组的发酵液中含菌量最多，即Y组较N组和Z组发酵液更适宜混合菌的生长。

表3 3种不同培养基发酵液A660值差异性检验

2.2 3种培养基抑菌效果观察

为了观察不同培养基对混合菌液拮抗能力的影响，将培养1 d以上的PT2′与QM34的混合培养液制成无菌发酵液，做拮抗试验，每种培养基3组重复，记录各组的抑菌圈直径大小（表4、图 1）。

表4 不同培养基发酵液的抑菌效果

从表4和图1可以看出，Y组培养基发酵液的抑菌圈大小高于N组和Z组，说明其拮抗能力显著高于N组、Z组发酵液的拮抗能力。

由图2可知，Y组发酵液的抑菌圈大小和吸光度均高于N组和Z组，由此可得出结论：PT2′与QM34在玉米粉液体培养基中混合培养，产生发酵液与其他2种培养基的相比，拮抗能力更强，即本试验中玉米粉液体培养基为最优培养基，这为下一步培养基的优化提供了理论基础。

2.3 玉米粉液体培养基的优化

为了进一步提高试验确定的最优培养基——玉米粉液体培养基的抑菌效价，我们在培养基中加入少量的MnS，并用SPSS软件对试验数据进行正交极差分析。

2.3.1 正交结果极差分析 从表5可以看出，当极差分析中以吸光度值为指标时，各因素的影响顺序为：B＞A＝C＝D＞E＞F；以抑菌圈大小为指标时，各因素的影响顺序为：A＞F＞B＞E＞D＞C，但仅以此数据还不能分析确定各因素的影响大小，所以需对其再进行方差分析来确定。

2.3.2 正交结果方差分析 分别以吸光度值A660和抑菌圈大小为标准，用SPSS软件进行方差分析，统计各因素对优化培养基配比影响的显著性结果。方差分析结果如表6和表7所示。

由表6、表7分析比较得知，以吸光度A660为衡量指标，各因素水平之间并没有显著性差异；相比较，各因素水平对抑菌圈的影响较大，因此，在选择水平的时候，将对抑菌圈的影响作为主要因素考虑。

表5 正交结果的极差分析

表6 依靠A660的方差分析结果

由表7可知，以抑菌圈大小为指标，因素A对拮抗菌的生长有显著性的影响，各因素影响大小顺序为：A＞F＞B＞E＞D＞C，极差表中分析得到最优组合为A2B2C2D1E1F1；表6中反映的影响顺序为：B＞A＞D＞C＞E＞F，分析得到最优组合为：A2B3C2D2E3F1。综合极差分析及方差分析可以得出，因素A，B，D无论是对拮抗菌的吸光度值，还是抑菌圈大小都产生了较为稳定的影响，同时，因素A，B表现出了显著的促进作用，而因素C，E则无显著影响，从而确定玉米粉液体培养基的最优组合为A2B3C2D2E1F1，即玉米粉150.0 g/L、糖化酶1.1 g/L、α-淀粉酶1.5 g/L、CO（NH2）25.0 g/L、KH2PO45.0 g/L。

表7 依靠抑菌圈大小的方差分析结果

3 结论与讨论

本试验通过对比，筛选出红提葡萄白腐病拮抗菌PT2′与广谱拮抗菌株QM34混合培养的最佳培养基，并且利用SPSS软件的分析，确定了最佳培养基的最优组合，这为今后工业上大规模生产发酵打下了基础。

同时通过查阅文献，在混合菌株的培养基中加入少量的MnS，以期提高混合菌株的拮抗能力。试验结果表明，MnS确实可以提高混合菌液的抑菌能力，但是对其中的菌量并没有显著影响，具体原因还有待进一步深入研究。

［1］晓雪.美国红提葡萄栽培技术[J].致富之友，2005（4）：45.

［2］郝云风，史有国，樊俊峰，等.美国红提葡萄快速育苗技术[J].内蒙古农业科技，2001（4）：9.

［3］王森.红地球葡萄主要病原菌的发生与综合防治[J].中外葡萄与葡萄酒，2002（1）：43-44.

［4］Pearson RC，Goheen AC（美）.葡萄病害防治[M].陈捷，杨伟纲，译.沈阳：辽宁科学技术出版社，1992：37-41.

［5］张中山.红提葡萄栽培技术及病害防治 [J].河南农业，2009（1）：36.

［6］杜东奇.红提葡萄病害防治中存在的问题及对策[J].山西果树，2007，3（2）：34-35.

［7］刘志恒.葡萄白腐病[J].新农业，2003（10）：36-37.

［8］赵奎华，陶承光，刘长远.葡萄病虫害原色图鉴[M].北京：中国农业出版社，2006.

［9］ Guetsky R，Shtienberg D，Elad Y，et al.Improving biological control by combiningbiocontrolagentseach with severalmechanisms of disease suppression[J].Phytopathology，2002，92：976-985

［10］吴艳，陶晶.芽孢杆菌组合CL-8发酵条件优化及其防病效能研究[J].农业工程学报，2008，24（7）：204-208.