ICAM-5对Aβ神经毒性的保护作用

涂秋云 丁斌蓉 杨 霞 唐湘祁 (中南大学湘雅三医院神经内科，湖南 长沙 4003)

近几年研究发现，脑卒中和脑缺血后阿尔茨海默病(AD)的发生率显著增加，缺氧是AD的病因之一〔1〕。但缺氧介导AD的病理过程的具体分子机制还不十分清楚。研究证实缺氧通过改变α、β和γ分泌酶的作用，修饰淀粉样前体蛋白(APP)的加工过程，导致Aβ的生成显著增加〔2〕，并且缺氧还可通过不同途径增加APPβ位点裂解酶1(BACE1)的基因和蛋白表达，导致Aβ的生成显著增加〔3〕。对于缺氧是否会增强Aβ的神经毒性，或缺氧可导致神经元细胞抵抗Aβ神经毒性的能力降低，目前还没有研究报道。细胞间黏附分子5(ICAM-5)在神经元的结构和功能发展中有重要作用，可促进神经元树突生长和突出可塑性改变〔4〕。在低氧的环境中，AD的发生率显著增加，这些是否与神经细胞在低氧环境下，细胞内的ICAM-5出现变化，从而使细胞的自我保护机制受损，Aβ对神经元的毒性作用增强，导致AD的发生率增加呢?在缺氧环境中，ICAM-5是否对Aβ神经毒性诱导的神经细胞凋亡有保护作用呢?目前国内外在这一方面尚未见研究报道。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人神经母细胞瘤细胞株(芬兰赫尔辛基大学生命科学院 Carl G.Gahmberg教授赠送的PAJU细胞);Aβ42(rPeptide公司);MTT(Sigma公司);DMEM powders(Gibco公司);胰蛋白酶粉(Amoresco公司);倒置相差光学显微镜(Nikon ELLIPSE TS100);低温高速冷冻离心机(Eppendorf)。

1.2 方法

1.2.1 Aβ42的“老化”处理 以储存浓度为231 μmol/L置于37℃的PBS中孵育7 d左右即为“老化”状态。

1.2.2 细胞培养 人神经母细胞瘤细胞系PAJU-ICAM-5细胞及PAJU-NEO细胞分别以5×105/孔接种于6孔细胞培养板，37℃，培养稳定后，分组:①常态组:常态PAJU-NEO细胞及PAJU-ICAM-5细胞组，50 ml/L CO2培养箱培养96 h;②Aβ干预组:将培养稳定的PAJU-ICAM-5细胞及PAJU-NEO细胞予以浓度为1.0 nmol/L老化的Aβ42干预，继续培养96 h;③缺氧组:将常态PAJU-NEO细胞及PAJU-ICAM-5细胞置于缺氧环境(1% ～2%O2、5%CO2、93%N2培养箱)培养 96 h;④Aβ 干预+缺氧组:将常态PAJU-NEO细胞及PAJU-ICAM-5细胞予以浓度为1.0 nmol/L老化的Aβ42干预，并置于1% ～2%O2、5%CO2、93%N2培养箱培养96 h。收取细胞样品，用倒置相差显微镜观察细胞形态的变化、MTT法观察细胞凋亡的情况。

1.2.3 MTT法观察细胞 检测细胞增殖取对数生长期的上述各组细胞，于干预前1 d以5×104/孔接种于无菌的96孔板中，继续培养24 h，然后再根据各组细胞的实验要求进一步按上述方法处理和培养至96 h，弃去培养基，加入5 g/L MTT 20 μl后继续培养 4 h，最后加入 150 μl DMSO，酶标仪测定各孔A490 nm吸光度值。计算公式:细胞存活率=(试验组A490值－空白对照组A490值)/(阴性对照组A490值－空白对照组A490值)×100%。

1.3 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，各时间点中各组吸光度值均以±s表示，用析因分析对各时间内各组吸光度值进行统计分析。

2 结果

2.1 倒置相差显微镜下观察结果 ①PAJU-NEO细胞分别经Aβ42处理、缺氧处理后，细胞数量减少，突起变短、减少;缺氧并Aβ干预组的细胞数量明显减少，突起变短、减少、甚至消失。② PAJU-ICAM-5细胞分别经Aβ42处理、缺氧处理后，神经突起分支数目无明显变化，仅突起变短、增粗，缺氧并Aβ干预组的细胞数量减少，突起变短。③PAJU-ICAM-5细胞的突起长度明显较PAJU-NEO细胞的突起长(P＜0.05)，PAJU-ICAM-5细胞虽经Aβ毒性作用，但无明显变短和损坏，细胞体相对较完整。见图1。

图1 各组细胞形态学变化(×400)

2.2 MTT比色法显示缺氧条件下Aβ42对PAJU细胞凋亡的影响 对照组PAJU-NEO细胞24、48和96 h后，存活率依次为(0.98 ±0.11，0.94 ±0.15，0.92±0.23，n=3);经 Aβ42处理24、48和96 h后，PAJU-NEO细胞存活率依次为(0.78±0.13，0.57±0.21，0.37±0.14，n=3);经缺氧处理24、48和96 h后，存活率依次为(0.82±0.17，0.67±0.24，0.63±0.14，n=3);同时经Aβ42和缺氧处理24、48和96 h后，存活率依次为(0.65±0.11，0.51±0.11，0.31±0.10，n=3)，经两两组间比较其差异具有统计学意义(P＜0.05)，另外，对照组与缺氧并Aβ42处理组间比较具有极显著差异，并具有统计学意义(P＜0.01)。说明缺氧、Aβ42对细胞存活具有一定的抑制作用，缺氧可以加重Aβ42对细胞存活的抑制作用，其抑制效应呈时间依赖性。

PAJU-ICAM-5组细胞，在经缺氧处理组、Aβ42处理组、缺氧并Aβ42处理组 24、48及 96 h后，细胞存活率依次分别为(0.99±0.11，0.97 ± 0.15，0.95 ± 0.23，n=3;0.89 ± 0.12，0.76 ±0.21，0.68 ±0.11，n=3;0.84 ±0.12，0.66 ±0.25，0.47 ±0.13，n=3;0.75 ± 0.13，0.68 ±0.11，0.52 ±0.19，n=3)，组间两两比较，对照组与低氧组、Aβ组比较，其凋亡率显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05);对照组与缺氧并Aβ42处理组比较，其凋亡率极显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.01);缺氧组与Aβ组比较，其凋亡率无显著变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。

PAJU-NEO细胞系与PAJU-ICAM-5细胞系分别予以相同的处理(缺氧、Aβ42、缺氧并Aβ42处理)后进行组间凋亡率比较有显著差异(P＜0.05)。

3 讨论

研究表明Aβ神经毒性涉及介导氧化应激及炎症反应、神经元内钙超载、诱导细胞凋亡、改变突触功能等多个方面〔5～10〕。我们研究发现Aβ干预PAJU-NEO细胞及PAJU-ICAM-5细胞后，细胞的形态发生了一系列变化:PAJU-NEO细胞系细胞数量减少，突起变短、减少;PAJU-ICAM-5细胞系细胞数量减少，突起变短，但突起数量无明显变化。同时，MTT法显示Aβ干预组的细胞存活率较常态组降低，且细胞的存活率随时间的延长而降低，说明Aβ可以降低细胞活性、诱导凋亡，进而说明Aβ的神经毒性之一是诱导细胞凋亡，且其抑制效应呈时间依赖性。

本研究发现，缺氧作为一个独立因素干预PAJU细胞后，PAJU-NEO细胞系细胞数量减少，突起变短、减少;PAJU-ICAM-5细胞系细胞数量减少，突起变短，神经突起无明显变化。同时，MTT法显示缺氧组的细胞存活率较常态组降低，且细胞的存活率随时间的延长而降低，说明缺氧作为独立因素可以降低细胞活性、诱导其凋亡，且其抑制效应呈时间依赖性。所以缺氧也可以导致神经毒性，与目前的观点缺氧是AD的重要危险因素之一相符合，但缺氧介导AD的病理过程的具体分子机制还不十分清楚。

本研究发现，缺氧的条件下培养PAJU细胞，更容易受到Aβ的毒性作用，其细胞的活力比单纯的Aβ干预、单纯的缺氧干预更低，其细胞形态受损更严重，说明缺氧可以促进Aβ的神经毒性。这与Egashira研究报道一致〔11〕。缺氧的条件下，可以加重Aβ的神经毒性作用，引起细胞形态和活性受损更加明显。

本研究发现，PAJU-NEO细胞系与PAJU-ICAM-5细胞系分别予以相同的处理(缺氧、Aβ42、缺氧并Aβ42处理)后，倒置相差显微镜显示:PAJU-ICAM-5细胞的突起长度明显较PAJU-NEO细胞的突起长，虽经Aβ毒性作用，但无明显损坏，细胞体相对较完整。同时，MTT法显示:PAJU-ICAM-5的细胞存活率明显高于PAJU-NEO细胞，提示ICAM-5在神经元内常量表达有助于促进神经元存活，提高其抵抗缺氧及Aβ42的神经毒性作用。

1 Sun XL，He GQ，Qing H，et al.Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2006;103(49):18727-32.

2 Li L，Zhang X，Yang D，et al.Hypoxia increases A beta generation by altering beta-and gamma-cleavage of APP〔J〕.Neurobiol Aging，2009;30(7):1091-8.

3 Zhang X，Zhou K，Wang R，et al.Hypoxia-inducible factor 1alpha(HIF-1alpha)-mediated hypoxia increases BACE1 expression and beta-amyloid generation〔J〕.J Biol Chem，2007;282(15):10873-80.

4 Gahmberg CG，Tian L，Ning L，et al.ICAM-5-a novel two-facetted adhesion molecule in the mammalian brain〔J〕.Immunol Lett，2008;117(2):131-5.

5 Berrocal M，Marcos D，Sepúlveda MR，et al.Altered Ca2+dependence of synaptosomal plasma membrane Ca2+-ATPase in human brain affected by Alzheimer's disease〔J〕.FASEB J，2009;23(6):1826-34.

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10 Erik Hjorth，Dan Frenkel，Howard Weiner，et al.Effects of Immunomodulatory Substances on Phagocytosis of Aβ1-42 by Human Microglia〔J〕.Int J Alzheimer Dis，2010;E Pub.

11 Egashira N，Iwasaki K，Ishibashi M，et al.Hypoxia enhances beta-amyloid-induced apoptosis in rat cultured hippocampal neurons〔J〕.Jpn J Pharmacol，2002;90(4):321-7.