阿仑膦酸钠对长期应用糖皮质激素大鼠股骨头骨组织MMP/TIMP系统的影响*

王建忠 王春生 王坤正＊＊ 周金秋

(1内蒙古医学院第二附属医院创伤骨科，呼和浩特010030;2西安交通大学医学院第二附属医院骨外科，西安710004;3解放军第253医院呼吸内科，呼和浩特010051)

基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase，MMPs)及其特异性抑制因子基质金属蛋白酶组织抑制剂 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)是参与降解包括骨在内的全身各种组织细胞外基质的蛋白酶家族。已证实MMPs/TIMPs系统在几乎机体各种组织的发育和修复[1，2]、肿瘤发生发展[3-6]、炎症反应[7]等过程中发挥着重要的作用，与激素性骨坏死的发生也存在一定关系[8]。

近年有研究表明，治疗骨质疏松常用药，第三代二磷酸盐，阿仑膦酸钠可以抑制MMP-2、MMP-9 mRNA表达，降低MMPs/TIMPs比率，抑制骨基质降解[9-11]。那么，是否阿仑膦酸钠可以通过对MMP/TIMP系统的作用来拮抗激素性骨坏死，值得我们进一步探讨。

在本实验中，我们对长期应用糖皮质激素SD大鼠，预防性给予阿仑膦酸钠干预，通过逆转录聚合酶链反应 (reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)，观察阿仑膦酸钠对大鼠股骨头骨组织 MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达的影响，评估阿仑膦酸钠是否可以通过对MMPs/TIMPs系统的作用来预防激素性骨坏死，为临床应用阿仑膦酸钠预防激素性骨坏死提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3个月龄的健康SD大鼠30只，雌雄各半，体重250～300 g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。

1.2 主要仪器与试剂

ABI 7000型Real time-PCR仪为美国ABI公司产品;醋酸泼尼松龙由湖北制药有限公司提供;骨组织RNA提取试剂Trizol为美国Invitrogen公司产品;逆转录-多聚酶链反应试剂盒为立陶宛Fermentas公司产品;引物由大连宝生物工程有限公司合成。

1.3 动物造模、分组及药物处理

30只大鼠随机分为激素组、阿仑膦酸钠组和对照组，每组10只，激素组和阿仑膦酸钠组给予12.5 mg/kg醋酸强的松龙肌注，阿仑膦酸钠组同时给予阿仑膦酸钠5 mg/kg灌胃，每周1次;对照组按同样的方法给予相同容积的生理盐水，每周2次。

1.4 组织学检查

用药4周后处死动物，取左侧股骨头，10%(体积分数)甲醛溶液固定，乙二胺四乙酸 (EDTA)脱钙，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切成5 μm厚切片，HE染色后，显微镜下观察，鉴定股骨头坏死情况。诊断标准参照2006年我国制定的股骨头坏死诊断和治疗的建议[12]:骨活检显示骨小梁的骨细胞空陷窝多于50%，且累及邻近多处骨小梁，有骨髓坏死。

1.5 RT-PCR检测

采用Real time PCR仪检测大鼠骨组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表达水平。

1.5.1 骨标本总RNA的提取 处死大鼠，快速取出右侧股骨大转子，剔除软骨后置于盛有1ml Trizol的研磨器中仔细研碎并孵育5 min，氯仿沉淀，离心后取上清。用等体积异丙醇沉淀RNA后离心去上清，750 ml/L乙醇洗涤，风干后用焦碳酸二乙酯处理水溶解，经过电泳证实提取总RNA完整性，RNA总量能够满足下一步实验。

1.5.2 cDNA第1链的合成 取总RNA 500 ng，加随机引物1μl，焦碳酸二乙酯处理水补至12μl，依照逆转录反应试剂盒说明书合成cDNA第一链，保存于-70℃冰箱。

1.5.3 RTQ-PCR检测 根据目的基因在GenBank中的己知序列，采用premier 5.0软件设计引物(表1)。选25 μl反应体系，参照Real time-PCR仪说明书，三步法进行PCR反应。反应条件:95℃35 s，1个循环预变性;95℃ 5 s变性，58℃ 20 s退火，72℃ 35 s延伸，45个循环。通过 ABI prism 7000SDS软件对各组目的基因作相对定量。

表1 实时定量PCR的引物序列

1.6 统计学处理

所有实验数据均采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。计量资料均数用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠股骨头骨组织HE染色表现

4周时，激素组与阿仑膦酸钠组各有1只动物死亡。死亡原因主要是饮食量逐渐减少，体重下降，全身逐渐衰竭而死。对照组股骨头骨组织切片HE染色可见骨小梁由板层骨构成，绝大多数小梁骨陷窝内可见骨细胞，小梁间为血管和骨髓。激素组表现为骨小梁稀疏和大量不连续的骨碎片及骨髓坏死，碎片骨陷窝内骨细胞大部分消失，周围有大量炎性肉芽组织，阿仑膦酸钠组介于二者之间，轻度炎性细胞浸润，骨小梁略纤细，多数小梁骨陷窝内可见骨细胞，小梁间为血管和骨髓 (图1)。

2.2 MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA 表达结果

三组目的基因RT-PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，根据片段大小，在相应位置出现目的条带(图2)。经RT-PCR检测出各组目的基因的表达水平 (表2)，结果显示:激素组与对照组比较，MMP-2、MMP-9 mRNA表达增高，TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表达水平降低，差异有统计学意义 (P＜0.05);阿仑膦酸钠组与对照组比较，除MMP-2有显著性差异外，其余无显著性差异;阿仑膦酸钠组与激素组比较，MMP-2、MMP-9 mRNA表达降低，TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达增加，差异有统计学意义。

3 讨论

MMPs及其特异性抑制因子TIMPs是参与降解包括骨在内的全身各种组织细胞外基质的蛋白酶家族。已证实MMPs/TIMPs系统在几乎机体各种组织的发育和修复[1，2]、肿瘤发生发展[3-6]、炎症反应[7]等过程中发挥着重要的作用，与激素性骨坏死的发生也存在一定关系[8]。

图1 三组大鼠股骨头骨组织HE染色 (×20)

图 2 MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达

表2 各组大鼠股骨头骨组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达

关于阿仑膦酸钠对MMP/TIMP系统的影响，有研究表明，二磷酸盐类药物对MMP-1、2、3、7、8、9、12、14、等多种MMP有抑制作用。Ichinose等[13]报道双磷酸盐减少培养的成骨细胞MMP-2的产生。研究表明单独应用双磷酸盐并不影响人成骨细胞产生MMP-2，但有生理浓度血浆存在的条件下，则可抑制成骨细胞中的MMP-2的分泌且同时诱导其降解，提示双磷酸盐于体内具有抑制MMPs分泌的作用。Cheng等[14]等通过对阿仑膦酸钠干预两种骨肉瘤细胞株的研究证实，阿仑膦酸钠呈剂量依赖性抑制细胞MMP-2 mRNA和蛋白表达。Teronen等[15]证实二膦酸盐在非细胞毒性浓度时抑制MMP-1，-2，-8，-9。Kim 等[16]研究证实，出生后7～10 d内的SD大鼠，给予阿仑膦酸钠可以降低髁状突软骨MMP-9的表达。Lai等[17]在探讨阿仑膦酸钠对软骨瘤细胞迁移和入侵的研究中发现，阿仑膦酸钠呈剂量和时间依赖性抑制MMP-2活性和mRNA水平和抑制软骨瘤细胞浸润。Maugeri等[21]通过调查60岁以上的绝经后骨质疏松患者。给予3种二膦酸盐治疗，并检测外周血循环中MMP-9水平和腰椎骨密度的水平，经过12个月的治疗。结果表明，血循环中MMP-9水平显著减少和骨密度增加。

皮质激素对MMPs/TIMPs系统的作用机理，研究发现，糖皮质激素通过与AP-1位点结合抑制胶原酶基因的表达，证实糖皮质激素能在转录水平阻断MMP基因表达[19]。关于阿仑膦酸钠对 MMPs/TIMPs系统的作用机理，研究表明，双膦酸化合物对MMPs的抑制作用主要是通过双膦酸基团与酶活性位点锌离子的络合作用，占据活性位点而产生抑制效应，而且，双膦酸的R2基团与MMPs S1空腔的结合也对其抑制效应有一定影响[20]。

在前期研究中，我们已经通过动物实验证实，糖皮质激素醋酸泼尼松龙可以促进大鼠MMP-2、MMP-9 mRNA的表达，抑制TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表达，认为长期应用糖皮质激素导致的骨坏死可能与其对MMPs/TIMPs系统的影响有关[21-22]。本实验中，我们通过对长期应用糖皮质激素的大鼠，预防性给予阿仑膦酸钠干预，观察到阿仑膦酸钠可以拮抗糖皮质激素的这种作用。提示阿仑膦酸钠可以通过对MMPs/TIMPs系统的“正性”干预作用，来拮抗糖皮质激素的“负性”作用，有效预防激素性股骨头坏死，为临床应用阿仑膦酸钠预防激素性骨坏死提供了实验依据。在下一步研究中，我们将通过临床试验，进一步证实阿仑膦酸钠能通过MMPs/TIMPs系统有效防止激素性骨坏死，为早期防治激素性骨坏死提供一条可能途径。

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