CALM2基因多态性与青少年特发性脊柱侧凸遗传易感性的关联性研究*

周 熹 邱贵兴 吴志宏 原所茂 费 琦 刘 正

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院骨科，北京100730)

青少年特发性脊柱侧凸 (adolescent idiopathic scoliosis，AIS)的发病原因及具体机制尚不清楚，多数学者认为其可能是多基因遗传病[1-5]。有文献报道钙调蛋白水平增高和进展性AIS之间有一定关联意义[6-12]，也有研究显示钙调蛋白 1基因(CALM1基因)的多态性与AIS不同亚型有一定联系[13]。与 CALM1基因一样，钙调蛋白 2基因(CALM2基因)同样参与钙调蛋白合成表达，本研究选择CALM2基因为考察对象，研究其多态性与AIS的遗传易感性之间的关系，并且对不同基因表型对AIS临床亚型之间的关联性进行了分析探讨。

1 材料与方法

1.1 研究对象

采用“病例-对照”研究方法，研究对象为中国汉族人群，包括散发性青少年特发性脊柱侧凸病例组和正常对照组。病例组来自2005年10月至2008年2月北京协和医院脊柱外科病房住院的中国汉族AIS患者 (Cobb角≥30°)，男17例，女90例，年龄范围10～22岁，平均15.53±2.18岁。所有患者通过临床和影像学确诊，排除其它类型的脊柱侧凸。分别记录所有患者PUMC分型[14]资料、侧凸顶点位置以及Cobb角。对照组来自同期北京协和医院就诊的外伤、感染患者及健康查体者，排除脊柱侧凸家族史和病史。对照组男17例，女90例，年龄范围10～20岁，平均15.12±2.59岁。所有研究对象和其家长签署知情同意书，并获得中国协和医科大学临床研究伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 SNP(single nucleotide polymorphyism，单核苷酸多态性)位点选择 在美国NCBI-SNPs数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)和欧洲Ensembl-SNPs数据库 (http://www.ensembl.org/index.html)中，查找 CALM2基因的已知SNPs。根据国际人类基因组单体型图计划 (http://www.Hapmap.org)提供的基因型数据，优先选取杂合度高于10%，位于外显子区域或有错义突变的SNPs和位于3'-、5'-调控区的SNPs作为遗传标记，共选取8个SNPs，具体见表1。

表1 筛查的SNPs

1.2.2 提取DNA 采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN公司)，根据它的Spin柱方案从外周全血中进行DNA的提取，并用分光光度法对其浓度进行测定，最终提取DNA浓度约为25 ng/Ixl。

1.2.3 DNA浓度测定和浓缩纯化 VeraCode GoldenGate Genotyping Assay检测SNPs所需的最佳浓度为50～100 ng/μl，较提取浓度高，因此采用离心重溶解的方式进行浓缩纯化，达到要求浓度。

1.2.4 SNPs检测 采用的VeraCode GoldenGate Genotyping Assay:96＆384-plex系统 (Illumina公司)进行SNPs检测。该系统采用光纤微珠芯片平台进行基因分型，得到SNP位点信息。

1.3 数据统计处理

应用SNPstats软件 (Availability:http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats)[15]、 SAS 8.2 软 件、Haploview 4.0(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)等统计学软件，进行基因型频率分布的Hardy-Weinberg(H-W)平衡检验，单位点和基因型统计分析。并结合基因-AIS临床表型进行关联分析。

2 结果

2.1 流行病学资料统计处理

通过卡方检验 (χ2检验，SPSS13.0)证实病例组和对照组的年龄 (P=0.306)和性别 (P=1.000)的构成比无统计学差异。

按PUMC分型将病例组107例患者分为Ⅰ组(PUMCⅠ型)22例、Ⅱ组 (PUMCⅡ型)76例、Ⅲ组 (PUMCⅢ型)9例。按照侧凸顶点位于T2～T11、12椎间隙为胸弯;侧凸顶点位于T12～L1为胸腰弯;侧凸顶点位于L1、2椎间隙～L4、5椎间隙为腰弯。107例AIS组患者按照侧主弯凸顶点位置分为胸弯组66例，胸腰弯组10例，腰弯组31例。

2.2 Hardy-Weinberg(H-W)平衡检验

Hardy-Weinberg平衡检验结果如表2所示，病例组和对照组中检测的各种基因型频数均符合H-W平衡，说明样本选择在人群中具有代表性。

表2 基因型Hardy-Weinberg平衡的拟合优度χ2 检验

2.3 基于等位基因的“病例-对照”关联分析

从表3中可以看出，阳性 (P＜0.05)位点位于编号SNP3的rs10153674(P=0.003)。具体分析可以得出，rs10153674(SNP3)等位基因 G，与AIS的易感性升高相关。

2.4 基于基因型的“病例-对照”关联分析

从表4中可以看出，阳性 (P＜0.05)位点位于编号SNP3的rs10153674(P=0.003)。具体分析可以得出，rs10153674(SNP3)等位基因型G/G，与AIS的易感性升高相关。

在表3和表4的基础上，对病例-对照组中基因频率或基因型有统计学差异的位点，利用在线的SNPstats软件，进行非条件Logistic回归模型分析。软件根据五种遗传学模型 (Codominant、Dominant、Recessive、Overdominant和Log-additive)的特点进行Logistic回归分析。结果见表5，AIC和BIC值越小说明模型越精确。因此rs10153674(SNP3)位点可能以Dominant遗传模型的方式与AIS的发生相关联。

2.5 基因型多态性与PUMC分型的关联分析

按PUMC分型将病例组107例患者分为Ⅰ组(PUMCⅠ型)22例、Ⅱ组 (PUMCⅡ型)76例、Ⅲ组 (PUMCⅢ型)9例。分别进行三组与对照组以及三组间SNP位点等位基因多态性分布频率比较。由表6结果可见，CALM2基因rs10153674和rs1027478位点在PUMC I型和对照组中的分布频率统计学上存在显著差异 (P=0.038和P=0.006)，进一步分析得知 rs10153674基因型 G/G、rs1027478基因型A/G与PUMC I型的发生有关。

表3 病例组和对照组SNP位点等位基因频率的关联分析结果

表6 PUMCⅠ型组与对照组SNPs基因型多态性分析

3 讨论

青少年特发性脊柱侧凸的具体发病原因目前尚不确定，但随着分子生物学研究的进展，更多的学者倾向于认为该病是个多基因相关的遗传疾病，其具体遗传模式仍未确定。

早在1979年，Yarom等[6]发现AIS患者椎旁肌细胞内Ca2+浓度上升，同时出现肌球蛋白的变性，与肌球蛋白异常相应的血小板中Ca2+浓度亦上升，导致Ca2+内稳态失衡。他们认为AIS患者可能存在广泛的细胞膜受损，因而出现椎旁肌以外的肌肉出现肌细胞内Ca2+浓度显著升高。Machida等[7]认为这种细胞膜的缺损会引起脊柱生长失调，从而导致脊柱侧凸的发生。Cohen等[8]报道AIS患者血小板CaM含量是正常人群的2.5～3倍，并与脊柱侧凸严重程度呈正相关。Kindsfate[9]和 Lowe[10]等研究发现进展性脊柱侧凸患者 (＞10度/年)与稳定性脊柱侧凸患者 (＜10度/年=相比，其血小板中CaM含量明显增高。国内，邱贵兴等[11，12]的系列研究发现AIS患者椎旁肌组织、关节突骨组织中钙调蛋白表达升高。

Benitez等[16]发现褪黑素的生理功能与钙调蛋白密切相关，并提出褪黑素和钙调蛋白相互作用学说，认为褪黑素与CaM动态结合后即被激活。褪黑素和CaM的结合具有强亲和性、可饱和性、可逆性、Ca2依赖性和配体选择性，结合以后的CaM几乎所有结构域都与褪黑素结合，故不会二级结构的改变。

总之，CaM与AIS关系密切，但其作用机制尚不明确。因此我们考虑，钙调蛋白的编码基因很可能是参与AIS发病的多个相关基因中的一个。邱贵兴等[13]的系列研究已经发现CALM1基因的多态性可能和特发性脊柱侧凸小同临床亚型相关联。本研究采用了全新的微珠芯片技术 (BeadArray)SNP检测方法，对CALM2基因的SNPs进行了检测，并取得了阳性发现。

SNPs分为两种:一种是位于基因编码区内(Coding region)的SNP，称为cSNP.cSNP又分为同义SNP(Synonymous SNP)和错义SNP(Missense SNP)两种。前者所致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，而后者碱基序列的改变可使翻译后的氨基酸序列发生改变，从而可能影响蛋白质的功能。另一种是位于基因组非编码区的SNP。这些SNP分布于内含子、5'-非翻译区(Untransltion region，UTR)，3'-UTR及其它区域。位于5'-UTR区域的SNP可能参与调控基因的转录和翻译过程，位于3'-UTR区域的SNP可能影响mRNA的稳定性及翻译过程，位于内含子的SNP可能影响mRNA前体的剪接。这些位于编码区和调控序列中的SNP可能引起蛋白质表达的质或量的变化，可能与致病相关，常被称为“功能多态性”(Functionalpolymorphism)[17]。 rs10153674 位 于CALM2基因的内含子1区，rs1027478位于内含子2区。目前尚没有文献对这两个SNPs位点的具体功能进行研究。

一般存在遗传标记位点和疾病关联的现象可归纳为两种情况:一种是遗传标记本身与疾病的病理发生有关;另一种是致病位点与遗传标记位点存在很强的连锁不平衡[18]。由此，我们推测这三个SNPs位点可能与疾病的病理发生无关，而是与某一致病基因位点存在很强的连锁不平衡。我们推测这三个位点碱基的改变可能影响CALM2基因转录翻译到CaM过程中的mRNA前体的剪切，使CaM的表达量上升，进而导致脊柱侧凸的发生。

AIS临床表现复杂，且其作为一种多因素影响疾病，不同的主效、微效基因可能决定不同的临床特征，所以结合AIS临床表型特征进一步分析。按照PUMC分型理论[14]，AIS根据侧凸的数量分为单弯、双弯、三弯，分别为PUMCⅠ、Ⅱ、Ⅲ型。按照现有观点认为AIS是多基因和环境因素共同作用的结果，但究竟遗传学因素对于双弯或三弯的发生起到何种作用，是直接激发双弯或三弯，还是直接激发单发，然后在环境因素的作用下继发次弯，还是这二者兼而有之，这是目前困扰我们的难题，也正是我们按照不同临床分析进行遗传学病因机制研究的目的。本组研究中证实PUMC I型AIS可能与CALM2基因rs10153674和rs1027478位点基因型多态性有关。我们据此推测:AIS不同的临床表型可能和不同的SNP位点多态性有关，而AIS的PUMC分型可能和不同的SNP位点多态性有关，提示PUMC分型不仅是指导临床治疗的可靠标准，而且可能是符合遗传病因学机制的合理分型，但这需要扩大样本量、全面分析候选基因SNPs位点后进一步研究证实。

AIS作为多基因遗传疾病，一个或多个基因导致不同的表型，任何一个基因均可能使患者处于易感状态，年龄、性别、环境因素的影响使基因表型趋于复杂化，只有证实控制多样表型基因范围的存在，才能进一步确定畸形相关基因。从基因水平探索引起AIS的病因是一个有意义的方向，合理应用连锁分析的研究成果，选择大量无亲缘关系的散发个体进行关联分析，有助于发现易感基因的精确位点。从基因水平上研究AIS的病因，探索和发现人类AIS的易感基因并进一步通过前瞻性队列研究实验来证实，设计出用于诊断的基因芯片或标记物，有助于提高孕期早期诊断AIS的水平，为优生优育作贡献。

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