抗原刺激后小鼠CD4+T细胞IL－10受体Ⅰ表达情况的研究

杨芳莉，刁骋，韦星呈，曾艳，严丹丹

(沈阳医学院基础医学院免疫学教研室，辽宁 沈阳 110034)

白细胞介素10(interleutin－10，IL－10) 是由 T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核巨噬细胞和树突状细胞产生的一种细胞因子［1－2］。也有研究指出调节性T淋巴细胞 (Treg)才是体内IL－10的主要来源［3］。人类和小鼠的 IL－10 受体 (interleutin－10 receptor，IL－10R) 由 IL－10R1 和 IL－10R2 两个亚单位组成。IL－10R2 不与 IL－10 发生结合，IL－10R1是IL－10R中与IL－10结合的亚单位，人类T淋巴细胞表面表达较高水平IL－10R1［4］，活化后的T细胞IL－10R1表达水平有所下调［5］。与人类不同的是，小鼠静息 T淋巴细胞表面不表达 IL－10R1［6］。国外有报道指出小鼠CD8+T淋巴细胞接受抗原刺激后IL－10R1在细胞表面可有短暂的表达［7］，但关于CD4+T淋巴细胞相关方面的报道较少。本实验对抗原刺激后小鼠 CD4+T淋巴细胞表面 IL－10R1表达情况进行检测，为进一步研究IL－10相关免疫疾病的发病及进展提供有力支持。

1材料与方法

1.1 材料 试剂：小鼠 anti－CD4－FITC标记荧光抗和 anti－IL－10R1－PE 标记荧光抗体均购自 Biolegend公司;anti－CD28 和 anti－CD3 抗体购自北京博奥森生物技术有限公司公司;RPMI－1640培养基和小牛血清购自GIBCO GRL公司;尼龙毛购自日本和光纯药工业株式会社 (WOKA)。实验动物：SPF级6～8周龄 C57BL/6小鼠 (雌性)10只购于北京大学医学部实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾细胞悬液的制备 处死小鼠，无菌条件下分离脾脏，注射器冲洗脾脏，无菌冷红细胞裂解液处理后，洗涤细胞。加入适量PBS，充分混匀细胞，调整细胞浓度至1×107cell/ml。

1.2.2 尼龙毛去除B细胞 称取尼龙毛100 mg，充分填塞于5 ml注射器针筒内，用适量PBS平衡。将脾细胞悬液缓慢经过尼龙毛，过滤两次，将所得细胞重新调整浓度至1×106cell/ml。

1.2.3 流式细胞术无菌分选CD4+T淋巴细胞加入 anti－CD4－FITC 标记抗体 1 μg/L × 106cells，室温避光孵育30 min，500 r/min，离心5 min，清洗两次后，500 μl PBS重悬细胞，经流式细胞仪无菌分选，收集得到的CD4+T细胞，用加有10%小牛血清的RPMI－1640调整细胞浓度至1×106cell/ml。将细胞放置于24孔培养板中无菌培养，1×105cell/孔。

1.2.4 抗原刺激 向各孔中分别加入 anti－CD3(1：200)和anti－CD28(1：200)多克隆抗体对细胞进行刺激，并且无菌培养。

1.2.5 流式细胞术检测IL－10R1表达情况 抗原刺激后0 h，12 h，24 h，48 h，72 h分别收集细胞，无菌PBS清洗，1 500 r/min，离心5 min。将细胞重悬于100 μl PBS中，轻弹起细胞，加入anti－IL－10R1－PE 抗体 0.2 μg/L × 106cells，室温避光孵育30 min，500 r/min，离心5 min，清洗两次后，500 μl PBS重悬细胞。以未加任何抗体的细胞做空白对照。流式细胞分析术检测CD4+T细胞表面IL－10R1表达情况。

2 结果

2.1 流式细胞术无菌分选CD4+T淋巴细胞结果(图1) 从图1可见大量CD4+T淋巴细胞被选出，符合进一步实验要求。

图1 流式细胞术分选CD4+T淋巴细胞结果图(方框中为分选出的CD4+T淋巴细胞)

2.2 流式细胞术检测刺激各个时段CD4+T淋巴细胞IL－10R1表达情况 (图2) 从图2可见，0 h时CD4+T淋巴细胞几乎不表达IL－10R1，12 h时IL－10R1表达上升，24 h时达到高峰，48 h时IL－10R1表达开始下降，72 h时表达水平与0 h接近。

图2 流式细胞术检测刺激各个时段CD4+T淋巴细胞IL－10R1表达水平结果图

3 讨论

本研究中，小鼠CD4+T淋巴细胞未接受抗原刺激时不表达IL－10R1，因此不能与IL－10结合并接受IL－10对细胞的调控。但是这种来源于IL－10的免疫调控作用在小鼠体内对T淋巴细胞并非无效，在抗原刺激后，小鼠CD4+T淋巴细胞开始逐渐表达IL－10R1，在24 h时达到顶峰，随后受体的表达水平开始下降，在72 h后恢复到未接受抗原刺激时 (0 h的水平)。可见在小鼠体内，IL－10作为一种重要的免疫抑制性调节因子，并不是始终直接对CD4+T淋巴细胞具有调节作用，这种直接的调节作用很可能体现在CD4+T淋巴细胞接受抗原刺激表达IL－10R1的短暂时间段内;在这个时间段内，IL－10也很有可能参与了CD4+T淋巴细胞的分化过程。与小鼠不同的是，人类CD4+T淋巴细胞在未接受抗原刺激时就表达高水平的 IL－10R1［4］，在接受抗原刺激后 IL－10R1 的表达水平有所下降。也有研究指出活化后的单核巨噬细胞IL－10R1 表达水平上调［5］，这提示在人类 IL－10 直接对T淋巴细胞的抑制作用随着活化是逐渐减弱，通过对抗原提呈细胞的抑制来间接对活化的T淋巴细胞起到很好的调控作用。总之，IL－10在小鼠体内和人类体内都对活化后的CD4+T淋巴细胞起到直接的调节作用，因此可以在模型小鼠身上研究在IL－10R1表达这一时间段内 IL－10对 CD4+T淋巴细胞直接作用，为进一步探讨在人体中IL－10对CD4+T淋巴细胞的作用提供强有力的帮助，从而对进一步揭示相关的自身免疫性疾病的发病机制和疾病进展情况，寻找治疗新靶点具有重要意义。

目前，IL－10基因作为系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus，SLE)遗传候选基因，成为研究SLE发病机制的热点，同时也因其免疫抑制功能而成为研究其他自身免疫病发病机制的重要靶点。有人发现小鼠IL－10对小鼠B淋巴细胞的作用，在小鼠IL－10R1分子胞浆区呈区段分布，且靠近细胞膜的一段区域与抑制性调节有关［8］。还有人指出NZW狼疮小鼠的IL－10R1基因在此区段具有突变，并且导致编码氨基酸发生改变，这有可能使IL－10的免疫抑制功能受到影响，成为狼疮发病的原因［6］。IL－10作为体内重要的免疫调节性细胞因子，进一步研究自身免疫病小鼠模型中IL－10通过IL－10R1对T淋巴细胞的调控机制，对揭示自身免疫性疾病的发病机制和指导临床治疗有重要意义。

［1］Ho AS，Moore KW.Interleukin－10 and its receptor ［J］.Ther Immunol，1994，1：173 －185.

［2］Moore KW，O’Garra A，de Waal Malefyt R，et al.Interleukin－10 ［J］.Annu Rev Immunol，1993，11：165 －190.

［3］Jankovic D，Kullberg MC，Feng CG，et al.Conventional T－bet－Foxp3－Th1 cells are the major source of host－protective regulatory IL10 during intracellular protozoan infection ［J］.J Exp Med，2007，204：273－283.

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［6］Qi ZM，Wang J，Sun ZR，et.al.Polymorphism of the mouse gene for the interleukin 10 receptor alpha chain(Il10ra)and its association with the autoimmune phenotype ［J］.Immunogenetics，2005，57：697－702.

［7］Partha SB，Virginia P，Alexander P，et al.Pathogen－specific CD8 T cell responses are directly inhibited by IL－10 ［J］.J Immunol，2007，179(7)：4520 －4528.

［8］Ho AS，Wei SH，Mui AL，et al.Functional regions of the mouse interleukin－10 receptor cytoplasmic domain ［J］.Mol Cell Biol，1995，15(9)：5043 －5053.