RANKL和M-CSF诱导THP-1细胞向破骨细胞样细胞分化的研究

刘天云

(天津医科大学口腔医院，天津 300070)

很多骨骼疾病是由破骨细胞的分化和功能异常引起的，如巨颌症、类风湿性关节炎、女性绝经后骨质疏松等。因此，对破骨细胞分化和功能的研究成为攻克这些疾病的关键。破骨细胞由单核细胞分化而来，在体外实验中，多采用外周血单核细胞(PBMCs)、脐带血单核细胞(UBMCs)和人类白血病单核细胞系U937和THP-1为前体细胞诱导得到破骨细胞样细胞。破骨细胞分化需要两个细胞因子——破骨细胞生成因子(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)［1］。PBMCs和 UBMCs直接在 RANKL和M-CSF的诱导下便可分化为破骨细胞样细胞［1～3］。PBMCs和 UBMCs分化来的破骨细胞样细胞更接近自然的破骨细胞，而U937和THP-1生成的破骨细胞样细胞体积较小，核的数量也少。但是由于PBMCs和UBMCs的不能增殖且分离复杂，限制了对破骨细胞的研究。因此，最理想的单核细胞来源还是能够无限增殖的单核细胞系。因为THP-1中可以检测到RANKL受体mRNA［6］，故我们尝试用RANKL和M-CSF直接诱导THP-1，看是否可以得到更接近天然的破骨细胞。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞因子RANKL和M-CSF购于美国Pepeotech公司，PMA购于美国Sigma公司，培养基RPMI粉末来自GIBCO公司，胎牛血清购于美国HyClone公司，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒购于天津血液研究所，Ⅰ型胶原购于美国的Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用RPMI1640完全培养基，含100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素和10%胎牛血清。细胞接种于75 ml培养瓶中，在37℃、5%CO2环境中培养，每3 d传代换液。

1.2.2 玻璃片铺胶原 将Ⅰ型胶原以1%的浓度溶于醋酸中，加入到铺有玻璃片的48孔板中放置10 min，然后回收胶原，晾干。在接种细胞前用PBS清洗3次，晾干后使用。

1.2.3 诱导分化 将 THP-1细胞以1×105/ml的密度接种到铺有玻璃片的48孔板中，加入浓度为1×107mmol/L的PMA刺激，每2 d换液除去未贴壁细胞，刺激4 d后停止。改加入RANKL(50 μg/ml)和 M-CSF(50 μg/ml)刺激，每3 d换液。

1.2.4 破骨细胞标志物检测 将玻璃片从培养板中取出，对细胞进行破骨细胞特有标记物——TRAP细胞化学染色。光镜下观察，TRAP阳性的多核细胞被称作破骨细胞样细胞。

2 结果

THP-1细胞在PMA刺激4 d后从悬浮单核细胞分化为贴壁细胞，细胞体积增大，向周围铺展(图1)。刺激到第10天时出现TRAP阳性的破骨细胞样细胞，与TPA/1，25(OH)2D3刺激得到的破骨细胞相比，体积大，细胞核数量多(图2)。

图1 贴壁巨噬细胞

图2 破骨细胞样细胞

3 讨论

THP-1细胞是从急性单核细胞白血病衍生来的，TPA刺激后从悬浮状态分化为贴壁细胞，停止增殖［7］。THP-1可以分化为巨噬细胞，而且与其他单核细胞系分化来的巨噬细胞相比，更接近自然的巨噬细胞［8］。这提示THP-1细胞本身就有更接近天然单核细胞的性质。这可能是 THP-1可以在RANKL和M-CSF的诱导下分化为破骨细胞样细胞的原因。

RANKL与其受体RANK结合后，通过多条信号通路激活多个核转录因子，这些核转录因子调节破骨细胞相关基因的表达。M-CSF是一种造血细胞生长因子，在破骨细胞分化过程中，它的主要作用是上调单核细胞内RANK的表达和支持细胞存活。RANKL和M-CSF都由间充质细胞和成骨细胞分泌。RANKL和M-CSF联合诱导分化是破骨细胞生成的经典途径，虽然有其他因子也可诱导破骨细胞分化，但是没有RANKL和M-CSF被完全取代的情况。在目前发现的所有非经典途径中RANKL是必须，而M-CSF可被其他因子替代。但是非经典途径中的细胞因子不能完全代偿M-CSF的功能，生成的破骨细胞与经典途径得到的破骨细胞相比，在形态上或者功能上存在差异［9～12］。

TPA是人工合成的生物试剂，它能够诱导THP-1和U937分化为巨噬细胞［8］，且刺激后能检测到RANK的mRNA水平增高。应用TPA之后，1，25(OH)2D3能够继续上调RANK的 mRNA的表达。1，25(OH)2D3能够刺激成骨细胞分泌 RANKL，有报道1，25(OH)2D3在造血细胞HL-60中抑制c-fms的 mRAN 的表达，c-fms是 M-CSF 的受体［13，14］。这些都暗示TPA/1，25(OH)2D3诱导的破骨细胞分化是与RANKL和M-CSF有密切关系的，是一条诱导破骨细胞分化的非经典途径。在实验过程中，我们发现传代太久的THP-1细胞不能被TPA诱导为完全的贴壁细胞，细胞短暂贴壁后又恢复为悬浮细胞。这可能由于细胞被传代次数太多，致使细胞的性状发生了轻微的改变，对某些因子的刺激不再敏感。TRAP是破骨细胞特有的标志物，在以上试验中我们验证了THP-1在RANKL和M-CSF诱导能分化为TRAP阳性的破骨细胞样细胞。在我们接下来的试验中将验证这些破骨细胞样细胞的破骨功能。

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