华北大黑鳃金龟对20种植物源挥发物的电生理和行为反应

邓思思， 尹 姣， 曹雅忠， 罗宗秀， 王 伟， 李克斌

（中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

华北大黑鳃金龟对20种植物源挥发物的电生理和行为反应

邓思思， 尹 姣， 曹雅忠， 罗宗秀， 王 伟， 李克斌＊

（中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

［目的］发掘能影响华北大黑鳃金龟行为反应的植物挥发性物质，以利用化学生态学技术调控华北大黑鳃金龟的行为，达到绿色防控的目的。［方法］采用触角电位（EAG）及Y型嗅觉仪行为测定技术，对20种植物挥发物进行筛选。［结果］在10μg／μL浓度刺激下，顺-2-己烯醇、反-2-己烯醇、乙酸顺-3-己烯酯、辛醛和苯乙醇能引起华北大黑鳃金龟触角较强的电位反应，总体趋势雌虫反应大于雄虫。行为测试中，反-2-己烯醇、芳樟醇、乙酸顺-3-己烯酯、1-己醇、邻氨基苯甲酸甲酯吸引能力都显著高于对照正己烷，但辛醛和苯乙醇对华北大黑鳃金龟的吸引作用低于对照正己烷，并呈极显著差异（p＜0.01）。［结论］华北大黑鳃金龟对本文所选的部分植物源挥发物对有显著的电生理和行为反应，该结果可为开发对其的田间引诱剂或驱避剂提供一定的理论依据。

华北大黑鳃金龟； 植物挥发物； EAG反应； Y型嗅觉仪

昆虫的觅食、寻偶、交配、产卵、逃避天敌等行为与环境中的化学信号关系紧密［1］。研究表明，植物释放出来的挥发性物质能引起昆虫的定向行为，是植食性昆虫搜寻寄主植物的重要刺激信号。目前，一些植物挥发物组分被证明对金龟子的行为有一定的诱导作用。例如，花的挥发物香叶醇、丁子香酚、邻氨基苯甲酸甲酯和（Z）-3-己烯-1-醇对分布在欧洲大部分区域的庭园发丽金龟（Phyllopertha horticola）有诱集作用，其中雄虫对（Z）-3-己烯-1醇的反应尤为强烈［2］，（邻）氨基苯甲酸甲酯能够引诱红铜丽金龟，且诱捕量是合成性信息素的5倍，不过对其他种类金龟甲没有引诱作用［3］。在乙烯利的诱导下，生姜可产生对中华喙丽金龟（Adoretus sinicus）具引诱作用的成分［4］。最成功的植物源引诱剂防治金龟子的例子是用丙酸苯乙酯、丁子香酚和香叶醇（3∶7∶3）的混合物对日本丽金龟的防治［5］，Ladd报道在其中加入鉴定出来的日本丽金龟性信息素Japonilure［（R，Z）-5-癸烯基2（3H）呋喃酮］使得引诱活性大大增加［6－7］。

华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）是一种昼伏夜出型昆虫，视觉刺激因素对其行为影响有限，所以寄主植物化学指纹图谱的导向作用对其更为重要［8］。宋协松报道，在华北大黑鳃金龟集中发生地区种植蓖麻诱集效果颇佳，平均每株蓖麻诱杀华北大黑鳃金龟多达40余头［9］。张艳玲在室内进行华北大黑鳃金龟对不同植物叶片的选择性试验，发现蓖麻叶的诱虫效果大于花生、大豆、榆树、杨树、苹果、柳树等常规寄主植物，随后对蓖麻叶挥发物组分进行GC-MS分析，其中存在顺-3-己烯醇、己醛、己烯醇、1-己醇等普通气味物质，也含有苯酚、苯甲醚、芳樟醇、α松油醇等其他金龟子的性信息素或聚集信息素成分［10］。

近年来，华北大黑鳃金龟在我国北方和沿海各省危害越来越重。据统计，2003、2004年河南新乡花生田受蛴螬危害分别占播种面积的66.7%和89.2%，罗宗秀等对河南省花生田地下害虫调查的结果表明华北大黑鳃金龟为花生田地下害虫优势种之一。防治此类幼虫为害期漫长的地下害虫，可以采用“幼虫为害，防治成虫”的策略［11］。为此，作者选取了20种植物挥发物，对华北大黑鳃金龟进行触角电位及行为测定，选择的20种气味物质包括了已证明对华北大黑鳃金龟有较好诱集效果的蓖麻叶中所含有的1-己醇、顺-3-己烯-1-醇、苯乙醇、芳樟醇、十六烷5种已鉴定出的挥发物、能引起多种昆虫EAG反应的植物挥发物常见组分反-2-己烯醇、对庭园发丽金龟具有诱集作用的邻氨基苯甲酸甲酯、引起扁绿异丽金龟强烈趋向行为的乙酸顺-3-己烯酯、能引起苹毛丽金龟EAG反应的顺-2-己烯醇和反-2-己烯醛以及文献报道的几种农作物的主要挥发物和能引起食性相近的金龟子产生触角电位的挥发物。通过对这些物质的筛选，旨在发掘能影响华北大黑鳃金龟行为反应的植物挥发物质，为研究开发高效、环保的引诱剂提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

供试华北大黑鳃金龟［Holotrichia oblita（Faldermann）］成虫于2010年6月采自河北省沧州市农林科学院附近草坪，饲养于内铺松软湿润土壤的塑料方盒中，置于温度28℃，光照L∥D＝16h／／8h的人工养虫室内，用新鲜榆树叶喂养。每次试验选择健康成虫进行触角电位和行为测试。

1.2 触角电位试验

1.2.1 味源

气味化合物标准品均购自Sigma公司（Sigma-Aldrich），纯度均为色谱纯（大于等于97%）。以色谱级正己烷为溶剂，将20种气味物质配成溶液。

1.2.2 触角的处理方法

据文献报道，对于触角较大的昆虫通常采用离体触角进行触角电位测试，一般触角在离体状况下，其生理活性可以持续几个小时，期间的触角电位测试数据是可信的［12］。金龟子触角为3片鳃叶状结构，在闭合情况下嗅觉感受器不能很好感受气味，以往的文献方法多采用玻璃电极连接触角，并用昆虫针分离触角鳃片，此方法可测得较高的EAG值，但基线往往欠稳定（图1）。

图1 华北大黑鳃金龟触角连接方法与EAG波形图（玻璃电极）

经作者尝试采用PRG-2型金属电极连接触角的方法可以得到较为稳定的EAG数据（图2），该方法利用华北大黑鳃金龟触角基部受到压力鳃叶会张开的特性，用小镊子轻轻捏住触角基部至鳃片张开，以刀片迅速切下触角，利用导电胶粘于电极上。

图2 华北大黑鳃金龟触角连接方法与EAG波形图（PRG-2金属电极）

1.2.3 EAG测试程序

昆虫触角电位仪购自Syntech公司，由CS-55气味刺激控制装置、MP-15微动操纵器、IDAC2数据采集控制器和触角电位记录显示输出装置组成。测试前取待测物质溶液滴加于滤纸条上（3mm×40mm），样品浓度为10μg／μL，每次10μL，将滤纸条塞入巴斯德管中，封口处理，待试验时取用。测试过程采用正己烷溶剂为对照，每个样品测试3次，每次均更换滤纸条，以避免浓度偏差对EAG值造成的影响。测试完每个样品均测试一次正己烷，重复6个触角，每个触角测试10个样品。刺激时间为0.5s，持续气流为500mL／min，刺激气流为40mL／min，刺激气流两次刺激间隔时间不少于1min，测试样品随机选取。触角对各气味物质的反应值用对正己烷的EAG值的绝对值表示［13］，即样品刺激反应值减去其前后正己烷刺激的反应值的平均值。

1.3 嗅觉反应测试

以引起较大反应EAG值的10种化合物进行Y型嗅觉仪测定。Y型嗅觉仪由玻璃管制成，内径3cm，主臂长为30cm，两测试臂长均为20cm，两者夹角为60°。样品由正己烷配制而成，浓度为10μg／μL。将10μL刺激样品滴加在滤纸条上，放入一测试臂中，另一侧为对照正己烷。进入管中的空气经过活性炭过滤和蒸馏水加湿，每臂空气流量计调为500mL／min。试验在20：00－12：00金龟子取食活跃期进行，选择标准为虫沿着柄端爬行或者飞行到两臂交接处，选择一臂进入超过5cm，并停留1min即确定为做出选择；如果停留在交接处超5min没有选择则确定为无反应。每10头虫作为一组，每个气味重复6组，测定一组试虫后用丙酮和蒸馏水冲洗Y型管，烘干后调换两臂与味源位置，以避免Y型管可能的不对称造成的误差。为避免光对金龟子选择的影响，试验在黑暗环境下进行，利用红色光源进行观察。

1.4 数据处理

所有数据统计分析均利用SPSS for windows 17.0进行处理，华北大黑鳃金龟对测试的气味物质EAG反应值采用Duncan’s多重比较法进行差异显著性比较；雌雄成虫对测试气味物质的EAG反应的比较采用t测验；Y型管试验中，华北大黑鳃金龟对测试气味物质及空白对照之间的选择性差异分析，采用卡方检测。

2 结果与分析

2.1 20种气味物质的EAG反应

20种气味物质均能引起华北大黑鳃金龟触角发生电位变化，但是反应强弱各异，各气味物质的EAG值及显著差异性见表1。具体看来，顺-2-己烯醇、反-2-己烯醇、乙酸顺-3-己烯酯、辛醛和苯乙醇能引起触角较强的反应（p＜0.05），雌虫触角对这几种气味物质的EAG值均超过1mV，雄虫触角也有较好的反应。十六烷、十一烷、柠檬烯和香叶烯等气味物质引起的触角反应较小。触角对α－蒎烯的反应是最小的，其EAG值仅比正己烷略高。

2.2 雌雄华北大黑鳃金龟对气味物质的EAG反应

通过雌雄华北大黑鳃金龟对各气味物质EAG数据的对比可以看出，华北大黑鳃金龟雌虫对气味物质的EAG值略高于雄虫。从表1中可以发现，20种气味物质中，只有3种物质能引起雌雄的EAG值达显著差异。总体看来，雌雄对各气味物质的反应差别不大，具有较好的一致性，因此性别在测定气味物质引起华北大黑鳃金龟EAG反应的试验中影响较小。

表1 华北大黑鳃金龟对20种人工合成植物挥发物的EAG反应1）

1）表中小写字母为20种物质引起华北大黑鳃金龟EAG反应值的Duncan’s多重比较法差异显著性比较结果，带有不同小写字母的同一列数据之间的差异达到显著水平（p＜0.05），“＊”表示同种气味物质引起雌雄华北大黑鳃金龟EAG反应值的t检验达显著差异（p＜0.05）。

2.3 嗅觉反应测试

从EAG测试的20种气味物质中选取10种作为嗅觉反应的候选化合物。其中1－己醇、邻氨基苯甲酸甲酯吸引华北大黑鳃金龟的能力显著高于对照，反-2-己烯醇、芳樟醇、乙酸顺-3-己烯酯吸引能力极显著高于对照；顺-3-己烯-1-醇、顺-2-己烯醇和2－甲基-1-己醇的吸引作用与对照相当；但是辛醛和苯乙醇对华北大黑鳃金龟的吸引作用竟低于对照正己烷，并呈极显著差异。

图3 华北大黑鳃金龟对10种气味物质的行为反应

3 讨论

Turrilazzi等报道烷类能作为某些社会昆虫的性信息素成分调节种群个体之间的信息交流［14］，经测定华北大黑鳃金龟对两种烷烃的EAG反应值非常小，表明这类化合物可能对其寄主植物搜索等行为不起作用。大栗鳃金龟（Melolontha hippocastani）、五月鳃金龟（Melolontha melolontha）和庭园发丽金龟利用顺-3-己烯-1-醇作为交配过程中定位寄主的线索［2，15］；该化合物也对苹毛丽金龟有活性［16］，但是非洲的一种金龟子Pachnoda marginataDrury对包括顺-3-己烯-1-醇在内的4种绿叶醇都没有嗅觉反应［17］。本试验行为测定结果显示华北大黑鳃金龟对顺-3-己烯-1-醇没有显著趋性，可能化学指纹图谱的种间差异导致不同种类金龟子对气味物质的选择性差异。

反-2-己烯醇作为植物挥发物的常见组分，能引起麦长管蚜、云斑天牛、绿盲蝽、棉铃虫处女蛾等昆虫较大的EAG反应值［18－21］，食蚜蝇、大草蛉对该化合物有显著的趋性［22］，从行为测试中可以看出，该物质同样对华北大黑鳃金龟具有较好的吸引作用。1-己醇普遍存在于多种绿色植物中，被称为“绿叶气味”，在本行为测试中也能引起华北大黑鳃金龟显著的趋性，这可能与该虫能取食多种不同的寄主植物有关。

苯乙醇能引起马铃薯甲虫、茶尺蠖、绒茧蜂产生强烈的电位反应，室内生测也表明该化合物对马铃薯甲虫具有很高的引诱率［23－25］，此外，苯乙醇还能引起苹毛丽金龟较弱的反应（0.2～0.4mV）［16］，本研究测试中，该化合物引起的华北大黑鳃金龟的EAG值却最高（EAG绝对值大于1mV），行为测试中也能引起极显著的趋性反应，值得注意的是苯乙醇引起的趋性反应显示为驱避作用，试验中辛醛与苯乙醇试验结果较为相似，但未见有这2种化合物作为驱避剂的报道，更为准确的结果需结合田间试验作进一步研究。

邻氨基苯甲酸甲酯被报道对庭园发丽金龟有诱集作用［2］，触角电位测试中，该化合物对华北大黑鳃金龟能引起较中等的反应值，雌雄反应几乎一致，且能引起显著的趋性反应，作者推测其可能对华北大黑鳃金龟子取食行为有一定的定向作用。芳樟醇是暗黑鳃金龟的性信息素的微量成分，单独使用没有引诱作用，但作为辅助物质能大大提升性信息素主成分异亮氨酸甲酯的生物活性［26］。本研究中，华北大黑鳃金龟触角对芳樟醇EAG反应值较高，雌虫反应稍高于雄虫，经Y型嗅觉仪测定显示极显著趋性。蓖麻挥发物中也存在芳樟醇［10］，可能该化合物是蓖麻对华北大黑鳃金龟具有引诱作用的一个因素。

本试验所有数据均是采用PRG-2型金属电极触角连接方法获得，试验所用华北大黑鳃金龟触角在基部受到压力情况下用刀片切下，与玻璃电极连接所用离体触角略有不同。两种方法所得触角均未受到损害，所得数据均具有参考价值，但是否能真实反映华北大黑鳃金龟对相应气味物质的反应，还有待于进一步的室内生测与田间引诱试验。植物挥发性化合物在植食性昆虫的寄主定位和求偶行为中都发挥着重要媒介作用。金龟子的求偶行为是在植物挥发物和性信息素综合作用下进行的，第一步是被取食的叶片释放植物挥发物，吸引同类聚集；接下来则由雌虫释放性信息吸引雄虫完成交配［27－28］，脯氨酸甲酯被鉴定为华北大黑鳃金龟性信息素主要成分，虽然室内生测具有一定的引诱效果，但效果欠佳［29］。本试验中对华北大黑鳃金龟具有较好吸引作用的挥发物质若能与性信息素综合作用，可为华北大黑鳃相关引诱剂开发提供基础，这将对绿色防治华北大黑鳃金龟具有重要意义。

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Electroantennographic and behavioral responses ofHolotrichia oblitato plant volatiles

Deng Sisi， Yin Jiao， Cao Yazhong， Luo Zongxiu， Wang Wei， Li Kebin
（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China）

［Objective］To select the plant volatiles which have impacts on the behavior ofHolotrichia oblita（Faldermann）and control it by chemical ecology principles.［Method］Twenty kinds of plant volatiles were chosen for electroantennogram test and bioassays.［Result］Cis-2-Hexenol，trans-2-Hexenol，cis-3-Hexenyl acetate，octyl aldehyde and phenethyl alcohol elicited a strong response in the antennae at the concentration of 10μg／μL，and the response of female was stronger than male.The behavioral attractiveness of the EAG active compounds was evaluated with bioassay experiments withHolotrichia oblita.In bioassays，trans-2-hexenol，linalool，cis-3-hexenyl acetate，1-hexanol and methyl anthranilate were found to be more attractive in comparison with hexane and octyl aldehyde，and phenethyl alcohol were less attractive than hexane.［Conclusion］H.oblitashowed marked electroantennographic and behavioral responses to some of the plant volatiles tested.The study may provide the theoretical basis for developing attractants or repellents forH.oblitain fields.

Holotrichia oblita； plant volatile； EAG response； Y-tube olfactometer

Q 965

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.010

2010-11-05

2010-11-22

公益性行业（农业）科研专项（201003025）；国家自然科学基金（31000853）

＊ 通信作者 E-mail：likebin54＠163.com