湖北省棉花主产区烟粉虱生物型分布及系统发育分析

周新改， 马伟华＊， 刘美刚， 杨小红， 王 沫

（1.湖北省昆虫资源利用与害虫可持续治理重点实验室，华中农业大学，武汉 430070；2.湖北省仙桃市植物保护站，仙桃 433000； 3.湖北省潜江市植物保护站，潜江 433104）

湖北省棉花主产区烟粉虱生物型分布及系统发育分析

周新改1， 马伟华1＊， 刘美刚2， 杨小红3， 王 沫1

（1.湖北省昆虫资源利用与害虫可持续治理重点实验室，华中农业大学，武汉 430070；2.湖北省仙桃市植物保护站，仙桃 433000； 3.湖北省潜江市植物保护站，潜江 433104）

［目的］明确武汉、荆州、孝感、随州、武穴5个棉花主产区烟粉虱生物型组成。［方法］通过以线粒体细胞色素氧化酶I（mitochondrial cytochrome oxidase I，mtCOI）为基础的PCR-RFLP和基因测序的方法，鉴定湖北5个棉花主产区烟粉虱地理种群的生物型组成，并分析5个地理种群与其他省种群的系统发育关系。［结果］Q型烟粉虱为湖北省棉花主产区的优势种群，而武汉温室种群则均为B型烟粉虱，土著生物型ZHJ1型在大田中略有分布；系统发育分析表明，湖北省棉花主产区B型和Q型烟粉虱种群均与中国其他多个省的烟粉虱种群亲缘关系较近。［结论］本文研究结果可以为湖北省5个棉花主产区烟粉虱的有效防治提供参考。

烟粉虱； 生物型； PCR-RFLP； 系统发育分析

＊ 通信作者 E-mail：weihuama＠mail.hzau.edu.cn 2006年在武汉地区大发生，烟粉虱由原来的次要害虫迅速上升为主要害虫［3］。目前，虽然已有报道称Q型烟粉虱在我国长江流域已成为优势种群［1］，但湖北省主要棉区烟粉虱生物型组成仍不明了。此外，外来入侵生物的系统发育关系研究对于阐明生物入侵途径、寻找有效天敌、了解生物入侵后生物学特性变化以及提出有效控制策略均有重要意义［4］。本文通过VspI-mtCOIPCR-RFLP分子标记技术，对湖北省主要5个棉花产区的烟粉虱地理种群生物型进行鉴定，以明确武汉、荆州、孝感、随州、武穴5个棉花主产区烟粉虱生物型组成，并构建系统发育树，分析湖北棉花主产区烟粉虱种群与其他省种群的亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

供试种群分别采自湖北五大棉花主产区，其寄主均为棉花‘鄂棉23’，地理种群、采集地、生物型、采集时间、样本量及GenBank查询码见表1。

表1 湖北省棉花上烟粉虱种群及生物型鉴定

1.2 单头烟粉虱DNA提取

参照 Kirk等［5］和 Frohich等［6］方法，略有改动。取单头烟粉虱在ddH2O中清洗，置于含有60μL碱裂解液（50mmol／L，Tris-HCl（pH8.0），20mmol／L NaCl，1.0mmol／L EDTA，1%SDS）的1.5mL离心管中，用匀浆器充分匀浆后，在55℃水浴锅中温育1h。取出后，加入2倍体积的预冷无水乙醇，冰浴2h。12 000r／min离心10min，去除上清液，70%乙醇清洗沉淀，再次12 000r／min离心10min，弃上清液后室温风干，ddH2O溶解后即可用于PCR反应。

1.3 PCR扩增及电泳

所用引物 C1-J-2195（5′-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3′），tRNA-1576 （5′-TATAAATCTTAAAACTGCA-3′）［7］。扩增出大小约为800 bp的PCR产物。PCR反应体系总体积为50μL，含2.5UTaq酶，引物C1-J-2195和tRNA-1576（10μmol／L）各2μL，模板DNA 2μL。反应体系于94℃预变性5min后，进行35个循环：94℃ 变性1min；50℃退火1min；72℃延伸1min。循环结束后72℃ 延伸5min。PCR产物于1%的琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后于凝胶成像系统下观察。

1.4 VspI-mtCOI PCR-RFLP鉴定生物型

PCR产物直接用于限制性内切酶VspI（特异性识别位点：ATTAAT）酶切反应，酶切的方法和步骤完全参照酶产品说明书（Ferment Inc.，Glen Burnie，MD）。酶切后于1%的琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后于凝胶成像系统下观察。B型烟粉虱个体的mtCOI基因片段酶切后为大小约700bp的单一条带，而Q型烟粉虱个体的mtCOI基因片段酶切后为大小约500bp和300bp的2条谱带［8－10］。

1.5 序列测定与数据分析

PCR产物纯化后送华大基因公司测序，测序结果提交至 GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）。得到的测序结果用Clustal W进行排序分析，比较所得序列之间的差异，并与GenBank中烟粉虱mtCOI部分序列进行比较。以温室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）相应的mtCOI基因片段序列为外群，通过p-distance模型构建系统发育聚类树（MEGA 3.0），系统发育树各分支的置信度（boostrap）均进行2 000次重复检验。

2 结果与分析

2.1 PCR-RFLP鉴别湖北五大棉花主产区烟粉虱地理种群生物型

PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明，每个样品的扩增产物约850bp（图1）。由图1可见，武汉、孝感、荆州、武穴和随州大田的烟粉虱种群的VspI酶切产物都会在电泳后显示两条可见谱带，一条大小约为500bp，另一条大小约300bp，而武汉温室的两个烟粉虱种群VspI酶切产物都会在电泳后显示1条大小约700bp的可见谱带。根据VspI-mtCOI PCR-RFLP鉴定生物型结果，采自武汉、孝感、武穴、随州和荆州大田的烟粉虱种群都为Q型，而采自武汉温室的烟粉虱种群均为B型（图1）。总体来看，湖北棉花主产区大田烟粉虱种群以Q型为主，而温室种群则均为B型烟粉虱。

图1 烟粉虱mtCOI DNA PCR产物及VspI酶切产物胶片图

2.2 系统发育分析

由图2可见，采自温室的烟粉虱种群与福建、云南、广东、广州、海南、山西、北京、内蒙古、河南、浙江以及山东的B型烟粉虱聚为同一进化支，而ZHJ型和外族温室白粉虱各聚为一进化支，说明湖北武汉温室B型烟粉虱与多个省份的B型种群亲缘关系较近。

图2 中国B型、ZHJ型烟粉虱系统发育树

与B型烟粉虱相似，采自湖北武汉、随州、荆州、孝感的烟粉虱种群以及武穴种群的大部分个体与多个省份的Q型种群亲缘关系较近，且所有Q型个体都处于同一分支（图3）。但是武穴种群的一部分烟粉虱个体（WuXue09-2，HM597858；WuXue09-4，HM597860；WuXue09-5，HM597861；2009年10月鉴定，表1，图3）与中国浙江的ZHJ1型种群聚为同一进化支，这不仅说明武穴的烟粉虱种群由Q型和ZHJ1型两个生物型组成（图3），而且也说明VspI-mtCOIPCR-RFLP技术在区分Q型和ZHJ1型烟粉虱时存在缺陷。2个月后，再次检测武穴品系生物型组成，则发现所有被测个体都为Q型烟粉虱（WuX-ue09-6，HM626150；WuXue09-7，HM626151；WuX-ue09-8，HM626152；WuXue09-7，HM626151；2009年12月鉴定，表1，图3），说明在室内饲养条件下，Q型烟粉虱的种群竞争能力优于土著ZHJ1型烟粉虱。

图3 中国Q型、ZHJ型烟粉虱系统发育树

3 讨论

烟粉虱生物型种类众多，除B型和Q型烟粉虱外，大部分生物型都分布在特定的区域。B型和Q型烟粉虱均是近20年来世界上分布范围最广的外来入侵物种之一，并分别在20世纪末和21世纪初侵入我国，使我国棉花、蔬菜及观赏植物等种植业蒙受巨大经济损失［11－12］。目前，烟粉虱的防治措施主要还是依靠化学防治，据报道，B型和Q型烟粉虱对药剂的敏感性往往不同，且不同生物型烟粉虱对寄主植物的适应性不同［13］，因此，明确烟粉虱地理种群的生物型组成，对制定合理有效的防治措施意义重大。本文通过VspI-mtCOIPCR-RFLP和mtCOI序列分析的方法，在湖北省五大棉花主产区共鉴定出3种烟粉虱生物型，它们分别是B型（武汉温室）、Q型（武汉、随州、武穴、荆州及孝感大田）和ZHJ1型（武穴大田）（表1）。其中，Q型烟粉虱分布最广，在所有采集地均有分布，为大田优势种群；B型烟粉虱仅在温室中有分布，且在温室中没有发现Q型个体；ZHJ1型仅在武穴棉区有少量分布，是唯一一个土著烟粉虱种群。万方浩等曾报道，Q型烟粉虱为长江流域的优势种群［1］，与本文结果一致。此外，分别于2008、2009年2次自温室采集到的烟粉虱种群不仅均为B型烟粉虱，且同源性极高（图2），说明B型烟粉虱种群在温室中能稳定存在，并可能常年发生，而不受Q型烟粉虱影响，与大田情况相反。总之，湖北省Q型烟粉虱在棉花大田条件下占绝对优势，而B型烟粉虱则在温室条件下优势较明显，土著生物型ZHJ1型在大田中也有零星分布。

系统发育分析表明，湖北省武汉温室B型和棉花主产区Q型烟粉虱均与多个周边省份烟粉虱种群亲缘关系较近（图2，3），说明入侵湖北的烟粉虱种群主要来源于国内种群迁入，而并非国外入侵种群直接侵入。此外，无论B型和Q型烟粉虱，所有被检测个体在系统发育树上都处于同一进化支，由此可以推测，中国多省B型或Q型烟粉虱不同地理种群间的遗传差异较小，这说明中国多省烟粉虱地理种群间基因交流较频繁，无明显地域阻隔。

武穴烟粉虱种群一部分与浙江的ZHJ1型聚为同一进化支，这不仅说明武穴的烟粉虱种群由Q型和ZHJ1型2个生物型组成（表1，图3），而且也说明VspI-mtCOIPCR-RFLP技术在区分 Q 型 和ZHJ1型烟粉虱时存在缺陷。据报道，PCR-RFLP技术是当前众多烟粉虱生物型分子鉴定技术中操作最简单、经济代价最低、应用最广泛的技术之一，且已有报道证明VspI-mtCOIPCR-RFLP技术可适用于鉴别世界各地的B型和Q型烟粉虱种群，而本文的发现却说明，该技术在用于鉴别Q型和土著生物型ZHJ1型烟粉虱时存在缺陷，需要后续研究寻找出更精确的烟粉虱生物型鉴定技术。

武穴烟粉虱种群在室内饲养2个月后的生物型组成为40%Q型和60%ZHJ1型（表1，图3），说明武穴种群在田间为Q型和ZHJ1型2个生物型组成的混合种群，且两生物型间的比例接近1∶1。但在室内饲养4个月后，该种群则变为Q型烟粉虱种群（表1，图3），说明ZHJ1型和Q型烟粉虱存在种群竞争现象，且在室内饲养条件下，Q型烟粉虱的种群竞争能力明显优于ZHJ1型烟粉虱，而与大田条件下的情况不同。但两生物型间的种群竞争机理尚不清楚，需要开展进一步的研究。

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Biotype distribution and phylogenetic analysis ofBemisia tabacipopulations in main cotton planting areas in Hubei Province

Zhou Xingai1， Ma Weihua1， Liu Meigang2， Yang Xiaohong3， Wang Mo1
（1.Hubei Key Laboratory of Insect Resources Utilization and Sustainable Pest Management，Huazhong Agricultural University，Wuhan430070，China； 2.Xiantao Station of Plant Protection，Hubei433000，China；3.Qianjiang Station of Plant Protection，Hubei433104，China）

［Objective］To understand the biotypes ofBemisia tabaciof cotton in main planting areas of Wuhan，Jingzhou，Xiaogan，Suizhou and Wuxue in Hubei Province.［Method］In this study，PCR-RFLP of mtCOI and gene sequencing method were used to identify the biotypes of whitefly field populations from main cotton planting areas in Hubei Province，and phylogenetic analysis of them was also conducted.［Result］The Q biotype was dominant in the field populations，while the B biotype was dominant in greenhouse populations.In addition，ZHJ1 biotype was also identified in Wuxue population.Phylogenetic analysis showed that populations from main cotton planting areas in Hubei Province were always homologous with populations from most other provinces in China.［Conclusion］The results may provide a reference for the control ofB.tabaciin Hubei Province.

Bemisia tabaci； biotype； PCR-RFLP； phylogenetic analysis

公益性行业（农业）科研专项（200803005）；植物病虫害生物学国家重点实验室开放基金（SKL2010OP03）；华中农业大学新教师经费（5220408080，5220409004）

S 435.622.9

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.012

烟粉虱［Bemisia tabaci（Gennadius）］又名棉粉虱、甘薯粉虱、银叶粉虱，在世界各地均有分布。其危害包括直接吸取植物汁液，分泌蜜露影响植物的光合作用，以及传播植物病毒，给农业生产造成了巨大的经济损失。烟粉虱是一个正处于快速进化过程的复合种（species complex），截至2005年，烟粉虱已有26个种群被赋予特定生物型，包括A、AN、B、B2、C、Cassava（木薯）、D、E、F、G、G／H、H、I、J、K、L、M、N、NA、Okra （秋葵）、P、Q、R、S、ZHJ、FJ型［1］，不同的烟粉虱生物型在寄主范围、传毒能力、地理分布及抗药性等方面存在显著差异［2］。

在湖北省，烟粉虱一直作为次要害虫存在，但于

2010-11-03

2010-11-25