激光共聚焦显微重建鲜红斑痣三维结构的初步研究

田克斌，韩丽林，江银华，周国瑜

（1.丽水市人民医院 口腔科，浙江 丽水 323000；2.上海交通大学附属第九人民医院 口腔颌面外科，上海 200011）

光动力治疗和脉冲激光治疗鲜红斑痣要取得好的效果[1-2]，必须对病灶的结构有清楚的了解，才能对治疗参数，比如能量、脉宽等做出相应的选择，达到理论上实现对血管的选择性破坏，周围正常组织得到保护。已有文献报道组织铸型、连续切片等技术进行组织的三维结构重建[3-4]，但鲜红斑痣常常不是由固定知名血管供血，使组织铸型技术难于实际应用，而连续切片耗时又浪费大量劳力，故也难以广泛应用。本研究通过厚切片、免疫荧光染色、利用“显微CT”[5]激光共聚焦显微镜观察，得到鲜红斑痣三维结构分布图像。

1 材料和方法

1.1 材料 选取我科临床、病理诊断为鲜红斑痣病1例的石蜡包块作标本，共5个石蜡块。患者男性，44岁，标本切取部位为面部，未经过治疗，皮损形态突出皮肤表面，暗红色，病灶压迫可褪色（见图1）。主要仪器：LSM 510 ZEISS 上海第二医科大学激光共焦室。主要试剂：鼠抗人anti-cd34（CHEMICON公司），羊抗鼠FITC标记二抗（长岛公司）。

图1 患者标本切取部位（面部）

1.2 方法

1.2.1 载玻片的处理：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5 min，室温过夜干燥，装盒备用。

1.2.2 厚切片的制备：30μm、10μm厚切片，同时制备4μm切片以便于对比。5个石蜡块的切片数目见表1。

表1 每个石蜡块切片的详细数目

1.2.3 染色：分别予HE常规染色、免疫组化染色、免疫荧光染色，以CD34标记血管内皮细胞，以便观察小血管及与周围组织对照。阳性对照：已知为CD34阳性的鲜红斑痣标本；阴性对照：正常皮肤组织；空白对照：以PBS液取代。

1.2.4 激光共聚焦显微镜重建：通过激光共聚焦显微镜观察切片，进行三维重建[5]：激光共聚焦显微镜能以一定厚度的层距沿轴向对组织进行分层扫描，得到一系列连续的光学切片，经A/D转换后作为二维数组储存，逐层扫描得到的二维数组通过计算机进行不同的三维重建算法，作单色图像处理，组合成真实的三维结构图形。

2 结果

除了4μm切片都完成全部染色过程外，10μm及30μm的切片很难完成全部染色，因为在免疫荧光染色的过程中，特别是抗原修复时，厚切片容易出现掉片，最后染色结果见表2。

表2 5例标本的免疫荧光染色结果

4μm的15片切片三种染色都能很好的完成；10μm的切片共25片，完成免疫荧光染色后17片脱片，都发生在抗原修复这一步，仅有8片染色成功；30μm切片共50片，它在染色的任何一步都有可能脱片，包括从开始脱蜡至水到后面漂洗过程，完成全部染色过程仅有3片。

4μm和10μm切片经激光共聚焦显微镜观察，可见血管内皮细胞很好地被特异性染色，周围组织非特异性的荧光很少见，经逐层扫描三维重建后（见图2），有完整的血管形态及很少量的立体分布信息。因组织量少，包含的血管空间体积少，三维重建后图像也比较小。

图2 三维重建后的图形

30μm切片经激光共聚焦显微镜观察，可见血管内皮细胞没有很好地被特异性染色，周围组织非特异性的荧光多见，经逐层扫描三维重建后，虽然也有完整的血管形态，但与周围组织不能很好地区别，因组织量大，可显示较多血管立体分布信息。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可不同的断面观察组织内部结构，测量血管管径、断层面积和体积等形态学参数。通过摸拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感，也可通过角度旋转和位置变化产生三维动画效果。

3 讨论

由于病变血管直径存在差别，激光仪器治疗参数应该是可调节的，但是早期激光仪器的脉冲、脉宽多为固定不变的，使得这类激光仪器很快被可以根据不同病变来调整脉宽大小的激光仪器[6]取代。为了精确地估计目标组织，临床工作者感到三维结构重建的必要性。因为三维图形更接近组织的自然状态，可直观地观察结构的分布，便于研究邻近结构的位置关系。激光共聚焦显微镜在三维结构重建[5，7]中，对组织逐点扫描，经空间滤波后，有效抑制干扰荧光，光源为单色性好的激光，基本消色差，成像聚焦后焦深小，可无损伤地对样品作不同深度的层扫描。没有组织切片二维图像的全貌显示、切片层间配准、切片变形、各个切片间均匀数字化采集等问题[4]。激光共聚焦显微镜能以一定厚度的层距沿轴向对组织进行分层扫描，得到一系列连续的光学切片，经A/D转换后作为二维数组储存。它在鲜红斑痣三维结构重建中的成功应用，使其成为一种简单易行的方法。

厚切片免疫荧光染色过程存在两个难点：①厚切片的制备：为了更好的重建鲜红斑痣的三维结构，要求组织有一定的厚度，但受切片技术、免疫荧光染色过程及激光穿透深度的限制。综合多方面因素考虑后，我们选定30μm厚切片作我们拟重建的组织厚度，相对常规组织切片的厚度4～6μm来说，虽然只差二十几微米，制作难度有很大差别。与常规组织切片相比，切片时石蜡块易出现破碎分裂、包埋组织与石蜡分离，很难切出包含完整组织的切片。在我们实验中，在切片前采用具有一定黏性的纸贴在将要切的组织面，起保护作用防止碎裂，切下组织片后在45 ℃温水中取下保护纸片，这样就完成厚切片的制备。②抗原修复的问题：30μm厚切片与10μm厚切片在抗原修复容易发生脱片，因使用的抗体要求用热修复抗原，当温度升高后原有的黏接物质被破坏，组织块与玻片之间分离，在漂洗时就出现脱片。为了防止脱片，进一步的研究是有必要的，其他的染色方法比如使用酶消化修复抗原的抗体，来防止脱片现象。

活体诊断研究的激光共聚焦显微镜的应用[8]使临床医生对人体鲜红斑痣三维结构进行观察成为可能，但是这项技术要在临床常规应用尚面临以下问题：①可视深度。②图像质量需进一步改善，为改善图像质量就有可能利用激光共聚焦显微镜重建的三维图形。③活体的激光共聚焦显微镜无法获得纵剖面的信息，因活体诊断研究的激光共聚焦显微镜的图像质量需要进一步改善，才有可能为临床提供有辅助价值的图像。我们利用组织石蜡切片的方法重建鲜红斑痣三维结构，可得到比较清晰的图片。如要达到既能在活体应用又能得到清晰图片的目标，一种可能的方法就是，先利用组织石蜡切片的方法重建大量鲜红斑痣标本的三维结构，同时用在活体研究的激光共聚焦显微镜记录粗略图形，然后把二者联系起来，建立数据库。临床遇到相应病例时就可依据数据库来选择治疗参数，从而对临床治疗效果和预后判断产生积极作用。

[1] 周国瑜,张志愿,张陈平,等.口腔颌面部静脉畸形及血管瘤的激光治疗研究[J].中华口腔医学杂志,2005,40(3):200-202.

[2] 张志愿,周国瑜. 颌面部血管瘤及血管畸形分类选择综合治疗研究进展[J].北京大学学报:医学版,2002,34(2):99-102.

[3] Smithies DJ, van Gemert MJ, Hansen MK, et al. Threedimensional reconstruction of port wine stain vascular anatomy from serial histological sections[J].Phys Med Biol,1997,42(9):1843-1847.

[4] 马慧军, 赵广,孟如松,等. 色素痣三维结构的实现与研究[J].CT理论与应用研究,2002,11(1):26-29.

[5] 细胞生物学教研室.细胞生物学技术[M].上海:上海第二医科大学出版社,2003:24-29.

[6] Astner S, Anderson RR. Treating vascular lesions[J].Dermatol Ther,2005,18(3):267-281.

[7] Zhang WH, Zhu SN, Lu SL, et al. Three-dimensional image of hepatocellular carcinoma under confocal laser scanning microscope[J]. World J Gastroenterol,2000,6(3):344-347.

[8] 田克斌,周国瑜. 激光扫描共焦显微镜活体组织诊断技术的应用进展[J].上海口腔医学,2006,15(1):97-100.