NF-κB和MMP-9在结直肠癌中的表达及意义

陈玉燕，谢杰斌，陈荣，叶乐驰

（温州医学院附属第二医院 肛肠外科，浙江 温州 325000）

结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率和造成的死亡人数在亚洲大幅增加，尤其是在我国[1]，位居癌症相关性死因的第四、第五位，其转移是造成患者死亡的主要原因。越来越多的证据支持核转录因子（nuclear factor of kappa，NF-κB）在肿瘤发生、浸润和转移中起重要作用。同时也有研究表明，基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）启动子区存在NF-κB结合位点，NF-κB促进肿瘤转移可能与上调血管生成因子以及MMPs的表达有关[2]。然而，联合研究NF-κB、MMP-9与结直肠癌的浸润转移的关系鲜见报道。本研究采用免疫组织化学SP法检测47例结直肠癌患者NF-κB及MMP-9蛋白表达情况，探讨两者与结直肠癌临床病理特征的关系。

1 材料和方法

1.1 标本来源及分组

1.1.1 结直肠癌组：收集我院2009年5月至2009年10月经手术切除、术中冰冻及术后病理诊断明确的结直肠癌标本47例，所有患者术前均未接受放疗、化疗或生物治疗。其中男34例，女13例；年龄32～84岁，平均年龄62.55岁（中位数63）；肿瘤直径＜5 cm者23例，5～10 cm者22例，＞10 cm者2例；局部有淋巴结转移者18例，无转移者29例；根据UICC结直肠癌TNM分期：0期4例，I期12例，II期14例，III期16例，IV期1例；高分化8例，中分化33例，低分化6例。所有标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋。

1.1.2 癌旁组：取上述结直肠癌癌旁肠管组织，距离癌灶最边缘2 cm，常规病理证实无肿瘤侵犯。

1.1.3 近端正常组：取上述近端正常肠管组织，距离癌灶最边缘10 cm以上，常规病理证实无肿瘤侵犯。

1.2 主要试剂 兔抗人NF-κB P65单克隆抗体（北京中杉）及山羊抗人多克隆MMP-9抗体为美国Santa Cruz公司产品，产品编号分别为：sc-372，sc-6840；两个SP试剂盒：内包含过氧化氢、封闭用山羊及兔血清、生物素标记的二抗、辣根酶标记链酶卵白素工作液，为福建迈新产品。柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液（PBS）、DAB显色剂、中性树脂、苏木素防脱玻片为北京中杉公司产品。酒精、二甲苯等购买于温州金山公司。

1.3 方法 每个蜡块4μm厚连续切片，采用免疫组化SP二步法检测，步骤参照试剂盒说明书操作。用PBS做空白对照，已多次检测为阳性的标本做阳性对照，抗体稀释浓度为1:100。

1.4 染色结果判断 根据阳性表达部位的信号强度和细胞数两种标准进行综合评分：①依据阳性细胞染色强度判断：细胞无染色，记0分；细胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅棕色背景为中等阳性，记2分；细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。②依据阳性细胞表达数：无阳性细胞表达，记0分；阳性表达细胞数≤25%，记1分；25%＜阳性细胞数＜50%，记2分；阳性表达细胞数≥50%，记3分。最后将两者评分结果相乘，其乘积结果为：①0分者为阴性表达，最终计为0分；②1分和2分者为弱阳性表达，最终计为1分；③3分和4分者为中等阳性表达，最终计为2分；④6分和9分者为强阳性表达，最终计为3分。最终得分为0分和1分者记为阴性，2分和3分者记为阳性。

1.5 图像分析 先在光学显微镜下观察免疫组化切片表达情况，然后每张切片随机选择5个阳性表达区域，在400倍视野下，采用Olympus相机在同一个光源、光圈、亮度、色彩饱和度、对比度及关闭白平衡条件下进行拍照，将所得图片输入计算机，应用美国Media Cybemetics公司生产的Image-ProPlus（IPP 5.1）图像分析软件进行图像分析。由于平均光密度值（mean optical density，MOD）能代表免疫组化图片的染色强度，能较为准确地反映阳性产物表达相对浓度；而且MOD在胞浆和胞核染色阳性的免疫组化标本中有较好的重复性[3]，故采用MOD作为测试指标进行定量分析比较。

1.6 统计学处理方法 采用SPSS16.0统计学软件。NF-κB和MMP-9蛋白分别在结直肠癌组、癌旁组与近端正常组的阳性表达率比较采用Chi-square Test，所有图像分析结果以±s表示，各指标与临床病理特征之间的关系采用t检验或方差分析，两指标表达相关性采用Pearson相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NF-κB和MMP-9蛋白在结直肠癌组织、癌旁组织及近端组织中的表达情况 NF-κB阳性细胞以胞质中出现棕黄色颗粒为主，部分见于胞核中（见图1a、b），阴性细胞未见棕黄色颗粒（见图1c）；MMP-9阳性细胞为胞质中出现棕黄色颗粒（见图1d、e）。阴性细胞胞质不染色（见图1f）。NF-κB蛋白在癌组织的阳性表达率为70.2%，明显高于癌旁组织的29.8%及近端正常肠组织的8.5%（均P＜0.01）；MMP-9蛋白在癌组织的阳性表达率为76.6%，明显高于癌旁组织的38.3%及近端正常组织的17.0%（均P＜0.01）。见表1。

表1 各组NF-κB和MMP-9蛋白阳性表达结果

2.2 结直肠癌组织中NF-κB和MMP-9蛋白的表达与临床病理特征的关系 NF-κB蛋白的阳性表达与结直肠癌细胞分化程度、临床分期及淋巴结转移有显著相关（P值分别为0.032、0.01和0.026），而与性别、年龄、肿瘤大小、部位及浸润深度均无相关性；MMP-9蛋白阳性表达与淋巴结转移有显著相关（P=0.034），而与性别、年龄、肿瘤大小、部位、浸润深度、细胞分化程度及临床分期均无相关性。见表2-3。

图1 NF-κB和MMP-9在各组织中的表达（SP，×400）

表2 NF-κB蛋白表达水平及其与临床病理特征的关系

2.3 结直肠癌组织中NF-κB和MMP-9蛋白表达的相关性 结直肠癌中NF-κB与MMP-9蛋白表达呈正相关（r=0.489，P＜0.01）（见表4）。

3 讨论

NF-κB是一类重要的核转录因子，可以调控细胞的增殖、凋亡、恶性转化及浸润和转移[4]。在正常细胞中，NF-κB主要分布于胞浆中，与其抑制物I-κB相结合，使其滞留在胞浆内呈非活性状态，当受到各种因素刺激时（如细胞因子、炎症因子等），细胞内的NF-κB被激活成为有活性的二聚体形式，转位到胞核，与靶基因上的κB序列特异结合，启动相关基因的转录，如炎性因子、黏附分子、化学趋化因子、基质金属蛋白酶，以及多种增殖和凋亡相关基因，NF-κB活性增强，进而使上述基因表达增加，后者促进细胞的恶性转化和转移[5]。大量研究都证明了NF-κB的活化与肿瘤恶性潜能有关，现已发现多种肿瘤组织中有NF-κB的高表达和高活性现象，可通过调控细胞的增殖、分化、凋亡及恶性转化影响肿瘤的发生发展[6]。然而，NF-κB与肿瘤分化、淋巴结转移、临床分期等关系上尚存在争议。本研究通过对47例大肠癌患者NF-κB蛋白的检测结果表明：NF-κB蛋白在结直肠癌组织的表达明显高于癌旁组织及近端正常组织（P<0.01），提示NF-κB可能参与了结直肠癌的发生发展，NF-κB的持续活化和高表达可能通过抑制细胞凋亡，促进细胞异常增殖等途径参与结直肠癌的发生和进展。另外，本实验的NF-κB与结直肠癌临床病理因素关系的分析结果显示，NF-κB与结直肠癌细胞分化程度、临床分期及淋巴结转移显著相关（P<0.05），目前认为的原因可能与其能够促进与肿瘤浸润、转移相关的重要因子如MMP-9、血管生成因子等的表达有关。

表3 MMP-9蛋白表达水平及其与临床病理特征的关系

表4 结直肠癌组织中NF-κB与MMP-9的相关性检验（n=47）

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一组与锌结合的主要分解细胞外基质的蛋白酶，与肿瘤的侵袭和转移关系十分密切，其中MMP-9又称明胶酶B，其作用主要是降解明胶、弹性纤维、II、IV、V、VII和X型胶原[7]。现已发现在多种恶性肿瘤中存在着MMP-9的高表达，在结直肠癌中，基底膜IV型胶原蛋白的缺失与肿瘤组织MMP-9的活化形式的表达增强有关[8]。有研究表明，MMP-9拮抗剂可以抑制结直肠癌细胞的移行和黏附[9]，从而提示MMP-9能促进结直肠癌细胞的侵袭和转移。目前，MMP-9在结直肠癌的定位、表达情况及作用尚无定论，有研究认为MMP-9只在结直肠癌组织中表达，也有研究称非癌组织中亦有表达，更有研究认为MMP-9在结肠炎相关性肠癌中作为一种肿瘤抑制因子起保护作用[10]。但大多数研究认为MMP-9可以刺激肿瘤生长，在大肠癌的进展和转移过程中起到关键的作用[11]。而我们实验结果显示：MMP-9蛋白在结直肠癌组织的阳性表达明显高于癌旁组织及近端正常组织（P<0.01），且MMP-9蛋白的阳性表达与淋巴结转移有显著相关（P<0.05），而与性别、年龄、肿瘤大小、部位、浸润深度、细胞分化程度及临床分期均无相关性，可能与观察例数较少，标本来源不同及染色方法不同等有关。以上结果说明，MMP-9与结直肠癌的淋巴结转移有着密切的关系，其机制可能跟MMP-9的降解作用使肿瘤细胞周围的物理屏障破坏、通过对细胞外基质的改建，促进肿瘤新生血管的形成，进而促进肿瘤细胞的淋巴结转移等有关。

虽然关于NF-κB与MMP-9蛋白在结直肠癌中的表达情况已有所研究，但联合研究二者与结直肠癌临床病理特征的关系，探讨其是否共同影响结直肠癌的发生发展以及浸润转移目前还鲜见报道。有研究表明，NF-κB可以调控人类恶性肿瘤中的MMP-9的表达[12]，它可以影响MMPs表达而调控转移，MMP-9启动子区存在NF-κB结合位点,EB病毒致瘤蛋白LMP-1活化区CTAR-1和CTAR-2能活化NF-κB而使MMP-9上调[13]。也有学者研究后推测肌醇六磷酸（IP6）通过调控转录因子如NF-κB和AP-1从而调节MMPs的表达[14]。这些研究都说明了NF-κB可能通过上调MMP-9而促进肿瘤的侵袭和转移。本实验研究发现，结直肠癌中NF-κB与MMP-9表达均较癌旁组织和近端正常组织升高，均与结直肠癌的淋巴转移有显著相关，且二者表达呈正相关（r=0.489，P＜0.01），提示了NF-κB可能通过上调MMP-9的表达而促进结直肠癌的淋巴转移，具体机制尚有待进一步研究。

综上所述，NF-κB和MMP-9的高表达与结直肠癌的淋巴结转移密切相关，二者在结直肠癌淋巴结转移中起着重要作用，联合检测NF-κB和MMP-9可能为判断结直肠癌的淋巴结转移提供新的生物学指标。

[1] Sung JJY,Lau JYW,Young GP,et al.Asia Pacific consensus recommendations for colorectal cancer screening[J].Gut,2008,57(8):1166-1176.

[2] Zheng H,Takahashi H,Murai Y,et al.Expressions of MMP-2,MMP-9 and VEGF are closely linked to growth,invasion,metastasis and angiogenesis of gastric carcinoma[J].Anticancer Res,2006,26(5A):3579-3583.

[3] 于萍,步宏,王华，等.免疫组化结果的图像分析与人工计数方法的对比研究[J].生物医学工程学杂志,2003,20(2):288-290.

[4] Sung B,Pandeg MK,Aggarwal BB.Fisetin,an inhibitor of cyclin-dependent kinase 6, down-regulates nuclear factorkappaB-regulated cell proliferation, antiapoptotic and metastatic gene products through the suppression of TAK-1 and receptor-interacting protein-regulated IkappaBalpha kinase activation [J].Mol Pharmacol,2007,71(6):1703-1714.

[5] Yamamoto Y,Gaynor RB.Therapeutic potential of inhibition of the NF-κB pathway in the treatment of inflammation and cancer[J].Clin Invest,2001,107(2):135-142.

[6] Mayo MW,Baldwin AS.The transcription factor NF-kappaB:control of oncogenesis and cancer therapy resistance[J].Biochim Biophys Acta,2000,1470(2):M55-62.

[7] Vu TH,Werb Z.Matrix metalloproteinases:effectors of development and normal physiology[J].Genes & Dev,2000,14(17):2123-2133.

[8] Zeng ZS,Cahen AM,Guillem J G.Loss of basement membrane type IV callagen is associated with increased expression of metalloproteinases 2 and 9 during humam colorectal tumorigenesis[J].Carcinogenesis,1999,20(5):749-755.

[9] Burg-Roderfeld M, Roderfeld M, Wagner S,et al. MMP-9-hemopexin domain hampers adhesion and migration of colorectal cancer cells[J].Int J Oncol,2007,30(4):985-992.

[10] Garg P,Sarma D,Jeppsson S,et al.Matrix metalloproteinase-9 functions as a tumor suppressor in colitis-associated cancer[J].Cancer Res,2010,70(2):792-801.

[11] Bjorklund M,Koivunen E.Gelatinase-mediated migration and invasion of cancer cells[J].Biochim Biophys Acta,2005,1755(1):37-69.

[12] Wang W,McLeod HL,Cassidy J.Disulfiram-mediated inhibition of NF-kappaB activity enhances cytotoxicity of 5-fluorouracil in human colorectal cancer cell lines[J].Int J Cancer,2003,104(4):504-511.

[13] Takeshita H, Yoshizaki T, Miller WE, et al. Matrix metalloproteinase 9 expression is induced by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 C-terminal activation regions 1 and 2[J].J Virol,1999,73(7):5548-5555.

[14] Kapral M,Wawszczyk J,Jurzak M,et al.Evaluation of the expression of metalloproteinases 2 and 9 and their tissue inhibitors in colon cancer cells treated with phytic acid[J].Acta Pol Pharm,2010,67(6):625-629.