结核分枝杆菌链霉素耐药临床分离株rpsL基因突变特征分析＊

魏淑贞，赵秀芹，刘志广，万康林

2.福建省疾病预防控制中心，福州 350001

结核病是结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）引起的慢性消耗性传染病。目前，结核病疫情日益恶化，耐药及耐多药现象十分严重。其中链霉素（streptomycin，SM）耐药比例居高不下。第4次全国结核病流行病学调查获悉我国结核分枝杆菌SM耐药率为17.3%，仅次于异烟肼（isoniazid，INH）耐药［1］，引起有关人士的高度关注。SM是最早用于治疗结核病的一线药物，由于结核分枝杆菌生长缓慢，运用传统的方法从分离，鉴定到获得药物敏感性结果往往需要6～8 w。因此，结核分枝杆菌SM耐药的快速诊断方法尤为重要，日益受到国内外学者的关注。为了解我国结核分枝杆菌SM耐药的情况和耐药基因突变的特点，以及为进一步快速检测SM耐药方法的建立提供依据，我们对从福建省、河南省、湖南省、安徽省和四川省及西藏自治区收集的结核分枝杆菌进行了SM耐药的相关研究。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 302株菌株由福建省（76株）、河南省（17株）、湖南省（58株）、安徽省（10株）和四川省（31株）及西藏自治区（110株）的结核病防治机构提供，结核分枝杆菌标准株H37Rv购买于中国生物制品药品检定所。

1.2 菌株分离鉴定和药物敏感性试验 菌株用改良罗氏培养基进行培养，用含对硝基苯甲酸（PNB）和噻吩－2－羧酸肼（TCH）的培养基鉴别结核分枝杆菌，牛结核杆菌和非结核分枝杆菌。根据WHO推荐的比例法［1］进行药物敏感性测定，含药培养基的药物临界浓度分别是：INH 0.2μg/m L，RFP 40 μg/m L，SM4μg/m L，EMB 2μg/m L和PAS 0.5 μg/m L。

1.3 提取DNA 乱取常规L－J培养基上生长良好的结核菌落，一菌环溶于400μLTE（p H8.0）中，在旋涡振荡器上震荡至块状固体菌落均匀溶于TE中，沸水浴15 min，快速离心，取上清备用。

1.4 扩增rpsL基因及测序检测rpsL基因（GeneID888259）是结核分枝杆菌染色体上的结构基因，全长375 bp，其编码核糖体蛋白S12。用Primer Premier5.0设计引物，扩增产物片段长为608 bp。上游引物为5′GGC GGC TTA CGC TTG ATG3′；下游引物为5′TCC GTA GAC CGG GTC GTTG3′。引物由赛百盛公司合成。PCR缓冲液，MgCl2，d NTP，Taq酶从上海生物工程公司购买。采用50μLPCR反应体系，其中包括模板DNA 9μL、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L d NTP、上下游引物各15 pmol和1.5 U Taq DNA酶。PCR的反应条件是：94℃5 min，94℃45 s，55℃30 s，72℃45 s，72℃5 min，30个循环。扩增整个rpsL基因。PCR产物先用1.5%琼脂糖凝胶电泳判断目的片段的位置（如图1），确认是单一的目的条带后直接送到上海生工公司进行纯化测序。

1.5 测序结果比对 测序序列以纯文本形式查询序列输入到 www.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST的查询框中，与H37RV的序列进行比对。同时排除测序引起的误差判断测序结果。

1.6 分析数据 菌株背景及测序结果用统计软件SPSS13.0分析相关数据，经χ2检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 药物敏感性试验结果 302株结核分枝杆菌临床分离株，SM 敏感株120株，占39.74%（120/302），其中59株对抗结核药物——INH、RFP、SM、EMB，PAS全部敏感，对SM敏感的耐药株有61株（其中耐多药46株）；对SM耐药的菌株有182株（其中耐多药150株），耐药率为60.26%（182/302），其中单耐SM 的菌株有6株，占3.30%（6/182），以含耐SM两种及以上药物耐药的菌株为主，占96.70% （176/182）。总 耐 多 药 率 为 64.90%（196/302）。具体的药物敏感性结果见表1。

表1 302株结核分枝杆菌药物敏感性试验结果Tab.1 Results of drug susceptibility test（DST）for 302 MTB isolates

2.2 PCR扩增产物电泳图片 用Premier5.0自行设计的引物扩增整个结核分枝杆菌rpsL基因，扩增产物片段长为608 bp。如图1所示为扩增产物，含整个rpsL基因片段。

图1 结核分枝杆菌rpsL基因PCR结果M：100bp分子量标准；0：阴性对照；H：结核分枝杆菌标准株；1～4：结核分枝杆菌临床分离株Fig.1 PCR results of rpsL in MTB M：DNA marker；0：Negative；H：H37Rv；1－4：MTB isolates

2.3 测序结果 302株结核分枝杆菌rps L基因测序结果经BLAST比对，168株没有检测到突变；134株存在突变。96株结核分枝杆菌rpsL基因第43位密码子发生AAG→AGG（Lys43 Arg，赖氨酸转变为精氨酸）突变 ，其中95株为SM耐药，SM耐药株发生突变的频率为52.20%（95/182）。37株菌株第88位密码子发生突变，其中5株SM敏感株发生AAG→AGG（Lys88 Arg，赖氨酸转变为精氨酸）的突变；32株SM耐药株第88位密码子发生突变，涉及4种突变类型，其中28株发生AAG→AGG（Lys88 Arg，赖氨酸转变为精氨酸）突变，Lys88Arg突变率为15.38%（28/182），有2株 AAG→ATG（Lys88Met，赖氨酸转变为蛋氨酸）突变，突变率为1.10%（2/182），AAG→CAG（Lys88Gln，赖氨酸转变为谷氨酰胺）和AAG→ACG（Lys88Thr，赖氨酸转变为苏氨酸）各有1株，突变率均为0.55%（1/182）。另外有1株SM耐药菌株第86位密码子发生CGG→CAG（Arg86Gln，精氨酸转变为谷氨酰胺）突变，突变率为0.55%。

2.4 药物敏感性结果与rpsL基因突变的关系59株结核分枝杆菌全敏感株rpsL基因没有发生突变。61株对SM敏感的耐药株中有6株菌株的rpsL基因发生突变。因此，SM敏感株rpsL基因突变率是5.00%（6/120）。182株SM 耐药株检测到基因突变的菌株有128株，SM耐药株的突变率是70.33%。SM敏感株和SM耐药株突变率的比较见表2。

表2 SM敏感株和耐药株基因突变率的比较Tab.2 Comparison of gene mutation rates in SM sensitive and SM resistant strains

2.5 耐多药菌株rpsL基因突变特点 196株耐多药菌株中有46株对SM敏感，150株对SM耐药。耐多药菌株中有110株rps L基因发生突变。对SM耐药且发生基因突变的106株耐多药菌株当中，有78株43位密码子AAG→AGG突变，占73.58%；有27株88位密码子发生突变，共4种突变类型，依次为23株AAG→AGG突变，占21.70%，2株 AAG→ATG 突变，占1.89%，AAG→CAG突变和AAG→ACG突变各1株，均占0.94%；另有1株86位密码子CGG→CAG（Arg→Gln）突变，占0.94%。详见表3、4。

表3 耐多药含SM敏感或耐药的菌株与rpsL基因变异的关系Tab.3 Relationship between rpsL mutation in MDR strains and SM susceptibility

表4 耐多药菌株基因突变位点与SM耐药的关系Tab.4 Relationship between mutation sites in MDR and SM resistance

3 讨 论

SM是第一个发现与核糖体相互作用的抗生素。1944年，Selman Waksman发现SM可用于治疗结核病，并与INH（H）、RFP（R）、EMB（E）成为治疗结核病的一线药物［2］。早在1946年，就已经有关于结核分枝杆菌对SM 产生耐药性的报道［3］。SM是在核蛋白体水平上干扰细菌蛋白质合成的。它主要的作用部位是核蛋白体的30S亚基，该亚基是由21种核蛋白体和1种16Sr RNA组成的。SM与核蛋白体30S亚基结合，抑制A位点功能，引起遗传密码的错读SM、翻译启动的抑制及异常校正，最终抑制蛋白质合成从而表现为抗菌活性［4－5］。核糖体蛋白S12的正常作用可能是维持读码过程中的一些轻微的不准确性，而突变的S12核蛋白却严格要求核糖体只使用与每一个密码子对应的氨酰－t RNA，从而抑制了SM诱导的遗传密码错读而产生耐药性［6］。

本研究对经药物敏感性试验确认为结核分枝杆菌的302株临床分离株进行rpsL基因的扩增测序，分析检测到的突变。SM敏感株120株，59株全敏感结核分枝杆菌临床分离株经测序没有发现点突变。61株SM敏感的耐药株中有6株发生点突变，其中1株43位密码子发生AAG→AGG（Lys→Arg）突变，5株88位密码子发生AAG→AGG（Lys→Arg）突变，故SM 敏感株的突变率是5.00%（6/120）。

182株SM耐药株包括6株SM单耐药和174株含耐SM的多耐药株，其中主要是以耐多药（HRS，HRES，HRSP，HRESP）为主，占81.87%（149/182），耐多药率是49.34%（149/302），远远高于第4次全国结核病调查显示的我国耐多药率（10.7%）［1］。这可能和标本的来源和标本的选择有关，本研究的标本均来自结核病防治医院，一般在医院治疗的病人多为结核病重症病例。SM耐药菌株发生的点突变主要以43位密码子和88位密码子均发生AAG→AGG（Lys→Arg）为主，43位密码子突变比88位密码子突变常见，这和国内外相关的报道一致［7］。研究发现88位密码子的改变涉及4种突变类型，除了常见的AAG→AGG（Lys→Arg）外，还发生AAG→ATG（Lys→Met），AAG→CAG（Lys→Gln）和AAG→ACG（Lys→Thr）突变，该位点的这些罕见突变［8］也曾经被报道过。由此可见，88位密码子的突变类型具有多样性。而在耐多药菌株中，SM敏感菌株与SM耐药株的88位密码子突变率之间的差异没有统计学意义（χ2＝3.47，P＝0.062）。本研究还发现1株86位密码子发生CGG→CAG（Arg→Gln）突变，目前没有见到国内外有相关报道，该突变位点与耐药的关系需要进一步验证。这些罕见的突变均发生于耐SM的耐多药菌株当中。

测序检测到SM耐药株有128株发生突变，突变率是70.33%（128/182），SM 敏感株的突变率是5.00%（6/120），两者之间的差异经卡方分析具有统计学意义（χ2＝125.05，P＜0.05）。耐多药含SM耐药的菌株rpsL基因突变率明显高于耐多药但SM敏感的菌株rps L基因突变率，经分析，两者之间的差异有统计学意义的（χ2＝54.90，P＜0.05）。耐多药含SM耐药的菌株rpsL基因43位密码子突变率明显高于耐多药，但SM敏感的菌株rpsL基因43位密码子突变率，经分析，两者之间的差异有统计学意义（χ2＝36.32，P＜0.05）。进一步证实了rpsL基因突变与结核分枝杆菌SM耐药高度相关，其中43位密码子AAG→AGG（Lys→Arg）突变是主要突变类型，PCR－DS检测rps L基因突变可以用于临床结核菌SM耐药的快速检测。本研究还有一部分SM耐药株没有检测到突变，提示SM耐药可能存在其他的耐药机制，有待于进一步的研究。正如Finken等曾报道了约25%结核分枝杆菌耐SM的临床分离株中存在正常的核蛋白S12和16Sr RNA，提示存在其它的耐药机制［9］。

［1］刘宇红，姜广路，赵立平，等.第四次全国结核病流行病学抽样调查——结核分枝杆菌耐药性分析与评价［J］.中华结核和呼吸杂志，2002，25（4）：224－227.

［2］Schatz A，Waksman S A.Effect of streptomycin and other antibiotic substances uponMycobacteriumtuberculosisand related organism［J］.Proc Soc Exp Bio Medical，1944，57：244－248.

［3］Klein M，Kimmelman L J.The role of spontaneous variants in the acquisition of streptomycin resistance by the shigellae［J］.J Bacteriol，1946，52：471－479.

［4］Ogle JM，Ramakrishnan V.Structural insights into translation fidelity［J］.Annu Rev Biochem，2005，74：129－177.

［5］Allen P N，H F Noller.Mutations in ribosomal S4 and S12 influence the higher order structure of 16S ribosomal RNA［J］.J Mol Biol，1989，208：457－468.

［6］Bohmann K，Ruusala T，Jelenc P C，et al.Kinetic impairment of restrictine streptomycin resistant ribosomes［J］.Mol Gen Genet，1984，198：90－99.

［7］Srinand S，XiPan，Stockbaner KE，et al.Characterization of rpsl and rrs mutations in streptomycin－resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from diverse geographic locatilies［J］.Antimicro Agents Chemoth，1996，40：1024－1026.

［8］Honore N，Marchal G，Cole S T.Novel Mutation in 16Sr RNA associated with streptomycin dependence in mycobacterium tuberculosis［J］.Antimicro Agents Chemother，1995，39：769－770.

［9］Finken M P，Kirschner A，Meier A，et al.Molecular basis of streptomycin resistance inMycobacteriumtuberculosis：alterations of the ribosomal protein S12 gene and point mutations within a functional 16S ribosomal RNA pseudoknot［J］.Mol Microbiol，1993，9：1239－1246.