幽门螺杆菌对甲硝唑的耐药性分析＊

张 姝，莫 非，孙朝琴，张 然，王 莹，李 寅，罗昭逊，夏曙华

幽门螺杆菌是浅表性胃炎、消化性溃疡的致病因子，与胃癌、胃粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤的发生密切相关［1］。目前治疗和控制Hp感染的主要手段是抗生素治疗，在治疗Hp感染的抗生素中以甲硝唑应用最广，随着甲硝唑的广泛应用，其耐药性问题日益突出，已成为治疗失败的主要原因之一［2］。Hp对甲硝唑耐药机制尚未完全明了，目前主要认为对氧不敏感的NADPH硝基还原酶（Rdx A）失活是导致甲硝唑耐药的关键，该酶的编码基因为rdx A基因［3］。有文献报道参与Hp对甲硝唑耐药的硝基还原酶还包括：3种铁氧还蛋白类似物（Fdx B）、NADPH 黄素氧还酶（Frx A）等［4－5］。但在 Hp耐甲硝唑机制的研究中，对fdx B和frx A的报道甚少，本文拟采用PCR扩增rdx A、fdxB和frx A基因，并对这3个基因测序分析，探讨Hp对甲硝唑耐药与rdx A、frx A和fdx B点突变的关系。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 采自贵阳医学院附属医院，60例患者因胃部不适行胃镜检查，标本取自其胃窦部或胃体部粘膜，并且C14尿素呼气试验为阳性的情况下，进行Hp的分离培养所得。国际标准测序株Hp26695株购自ATCC。

1.2 主要试剂 E－Test试验条、微需氧袋：法国梅里埃公司；哥伦比亚血琼脂粉：OXOID；DNA提取试剂盒：北京天恩泽基因科技有限公司。

1.3 Hp的分离培养及鉴定 取胃窦部内镜活检组织，接种于幽门螺杆菌选择培养基平板，微需氧37℃培养3～7 d，进行Hp鉴定及培养。

1.4 药敏试验 采用E－Test法检测Hp对甲硝唑的最低抑菌浓度（MIC）。用 Hp标准测序株Hp26695作每批试验的质控标准。以MIC值≥8 μg/m L判定为甲硝唑耐药，MIC值≥32μg/m L判定为高水平甲硝唑耐药［6］。

1.5 Hp基因组DNA提取 提取DNA按照试剂盒说明书操作。用紫外分光光度计对提取的DNA纯度进行测定，计算 OD260nm/OD280nm比值。模板DNA于1.0%琼脂糖凝胶孔中电泳。

1.6 PCR 扩增 根据文献［7］设计rdx A、fdx B和frx A基因的特异性引物，见表1。引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体系为反应体系为50μL，其中包括：dd H2O 19μL，上游引2μL，下游引物2μL，模板DNA 2μL，Primix Teq 25μL。循环条件：预变形94℃，5 min；变性94℃，30 s；退火53.7℃（其中fdx B退火59℃～60℃，frx A退火59℃～60℃）；延伸72℃2 min；最终延伸72℃，10 min。每次扩增时均设置阳性对照、阴性对照及空白对照。最后琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

表1 rdx A、fdxB、frx A引物序列Tab.1 Primers of rdxA，fdxB and frx A

1.7 PCR产物测序及序列分析 PCR产物送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。测序结果经美国国立生物技术信息中心（NCBI）中的BLAST软件分析。

2 结 果

2.1 Hp的培养及药敏结果 60例病人胃粘膜标本分离出11株Hp，经革兰氏染色镜检呈阴性，菌体细长弯曲呈螺形，S型或海鸥型。过氧化氢酶实验、氧化酶实验及尿素酶实验，均为阳性。采用ETest法测定11株临床株对甲硝唑的MIC均≥256 μg/m L，为高水平耐药株。

2.2 PCR扩增结果 11株临床株和国际标准测序株Hp26695的DNA纯度经紫外分光光度计测定，260 nm/280 nm比值均在1.8～2.0之间。PCR扩增出11株临床株和1株标准株rdx A、frx A和fdxB基因，分别在750 bp、870 bp、830 bp位置出现特异条带，见图1。

图1 模板DNA及PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图注：A图为模板DNA；B图为rdx A；C图为fdxB；D图为frx A；M：DNA marker；阴：阴性对照；阳：标准株Hp26695；其余为临床株。Fig.1 Agarose gel electrophoresis maps of DNA templates and PCR amplification productsNote：Picture A for DNA templates；B for rdx A；C for fdxB；D for frx A；M for marker，positive for the standard strain Hp26695，the rest for clinical strains

2.3 产物测序结果 11株临床株与NCBI已登录的国际标准测序株Hp26695相应基因组序列比对，发现rdx A、fdx B、frx A基因存在碱基替换、插入和缺失3种类型的突变，这些基因突变呈现出一定的规律性，即在某些位点存在共同突变（共同突变位点见表1），除此，还存在随机位点的散在突变。耐药菌与敏感菌核苷酸同源性：rdx A和fdxB为95%～98%，frx A低于94%。

3 讨 论

硝基咪唑类药物甲硝唑（MTZ）是一种具有抑菌活性的药物前体，经Hp的细胞膜被动扩散进入胞浆，在胞浆中的硝基还原酶的作用下，能获得低于－430 m V氧化还原电位，使甲硝唑的硝基还原成羟胺衍生物，还原产物与DNA作用引起链断裂，导致细菌死亡，这是甲硝唑的抗Hp机制［3，8］。因其杀菌活性不受胃内低p H的影响，在胃腔内浓度高，具有较强的抗Hp活性，因此常用于Hp感染的一线治疗［9］，是三联方案中最广泛应用的抗菌素之一。随着抗生素的广泛使用，Hp对甲硝唑的耐药率呈逐年上升趋势。本实验从60例病人胃粘膜标本分离出11株Hp菌株，采用E－Test法测定11株临床株对甲硝唑的MIC均≥256μg/m L，均为高水平耐药株。

表2 11株耐药菌rdx A、fdxB和frxA基因的相同突变位点和突变形式Tab.2 The same mutations sites and forms of rdxA，fdxB and frx A in 11 resistant strains

Kwon等研究表明Hp对甲硝唑耐药与编码参与甲硝唑氧化还原反应的酶的基因（rdx A、frx A、fdx B）突变有关［10］。这些基因的碱基插入、缺失、转化等导致下游氨基酸序列全部或部分发生改变，导致其翻译的蛋白质改变，引起硝基还原酶活性降低或失活，不能还原甲硝唑而引起耐药。但对氧不敏感的NADPH硝基还原酶（Rdx A）最为关键，国外有研究表明，耐甲硝唑的Hp中的Rdx A蛋白缺失或生成减少［11－12］。本研究对11株耐药菌和1株敏感菌进行rdx A扩增并测序，发现11株耐药菌均存在插入、缺失和碱基转换3种突变类型，以碱基转换为突变的主要类型，未发现大片段序列插入或缺失，只出现单个碱基插入或缺失，即均表现为点突变。已有报道认为耐甲硝唑Hp菌株的rdx A基因突变大多为随机性的，未能肯定某一位点突变与耐药直接相关［13］。本试验也发现rdx A基因变异位点大多不固定，但11株耐药菌存在4个固定的突变位点，即均发生了1013598nt A→G，1013619nt G→A，1013961nt C→T，1014149nt A→G，这些位点的改变均未见文献报道，我们推测这些位点的突变与甲硝唑的耐药可能有密切的关系。

Hp的frx A基因和fdx B基因的变异在Hp对甲硝唑中－高度耐药中发挥重要作用［4］。有研究证实单一fdx B基因突变导致Hp对甲硝唑的低水平的耐药甚至不耐药，rdx A或frx A基因突变会产生中等程度的耐药，但当rdx A与fdx B或frx A联合突变则会产生高水平耐药［10，14］。本文对11株高水平耐药菌的frx A基因和fdx B基因进行扩增和测序分析，发现耐药株和标准株均携带有frx A和fdx B基因，且发生不同程度的变异，多表现为随机位点的插入、缺失、转化及颠换，未发现大片基因的插入，但是同时也呈现出一些规律性的变化，如：frx A基因测序结果在以下3个位点出现了共同突变：688585nt T插入，688470nt C→T，688041nt T→C，同源性为95%～98%；fdx B的基因测序结果表明，11株高水平的耐药株均发生变异，有以下共同突变位点，即 1581618nt处 G→A，1581795ntC→T，1581996nt T→C，1582038nt T→C，同源性低于94%。我们推测这些高频的突变位点可能在该基因所编码的蛋白产物失活中起重要作用。从本研究的实验结果来看，11株高水平耐甲硝唑的Hp菌同时发生了rdx A、frx A和fdx B基因突变，这在一定程度上证实了frx A和fdx B基因突变在rdx A基因突变所诱导的甲硝唑耐药中起协同作用。frx A基因和fdx B在甲硝唑耐药中是否单独起作用还需要增加甲硝唑敏感株，需要更多的实验数据去做进一步的研究。

研究Hp对甲硝唑的耐药机制可揭示药物作用细菌后信号转导机制，为个体化用药以及选择合适的抗生素用于临床治疗奠定基础。本文从基因组角度探讨Hp对甲硝唑耐药的分子机制，提示了Hp对甲硝唑耐药性不仅可能与rdx A点突变有关，同时亦可能与frx A和fdxB基因突变相关。为进一步研究和分析Hp耐药机制提供了有价值的资料。

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