利用磁珠法结合MALDI-TOF MS进行慢性心衰气阴虚证血液蛋白质组学研究的方法学探讨

杨 鸿，周春喜，李晶哲，马琰岩，于友华，喻晓春，林 谦，逯金金

(1.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700;2.北京中医药大学东方医院，北京 100078;3.美国布鲁克公司北京技术支持中心，北京 100081)

近年来，发展迅速的蛋白指纹图谱技术由于其高灵敏性和高特异性，克服了以双向电泳、多维液相色谱为核心的传统蛋白质组学技术在重复性、高通量等方面存在的缺陷，有望成为今后探索中医证候本质的新研究方法;但在该技术应用过程中仍有许多问题需要进一步解决，如证候样本的收集和预处理方式、蛋白分离提取方法、实验体系的稳定性和重复性等因素都会影响实验分析的结果，最终都需要通过标准化处理来加以解决。本文以慢性心衰气阴虚证为研究对象，通过应用磁珠法结合基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技术分析慢性心衰气阴虚病人血液蛋白和多肽组分，探索和完善中医证候蛋白质组学研究中的样品收集及预处理、分离制备、检测等方法，为有效获取中医证候血液蛋白及多肽图谱，深入分析中医证候物质基础确定可行的技术方法。

1 材料与方法

1.1 研究对象

慢性心衰气阴虚证(依据《指南》标准，慢性心衰C期(既往或目前有心衰症状)患者，依据慢性心衰中医证候诊断标准诊断有气阴虚证的患者。年龄30岁～70岁)，18例来自北京中医药大学东方医院，18例对照血样来自健康志愿者(年龄30岁～70岁)。

1.2 血液样品收集与预处理

采用EDTA-K3抗凝管、聚丙烯干燥管采集患者治疗前或健康志愿者外周血各4ml，室温静置1h，4℃ 3000r/min离心10min，分离血浆、血清分装于500μl EP管中，冻存于－80°C备用。使用前取出血液样品，冰上融化。

1.3 仪器与试剂

EDTA-K3一次性真空采血管及血清真空采血管，奥地利格雷那公司;铜螯合(IMAC-Cu)磁珠试剂盒，弱阳离子(WCX)磁珠试剂盒，标准品(preptide和 protein混合物)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)，德国Bruker Daltonics公司产品;三氟乙酸(TFA)、乙腈(ACN)，美国 Sigma公司产品;Allegra 25R低温离心机，美国 BECKMAN产品;Autoflex Ш MALDI-TOF/TOF质谱仪，德国 Bruker公司产品。

1.4 血液蛋白及多肽提取方法

按照IMAC-Cu和WCX磁珠试剂盒说明书要求，将CHF气阴虚证和健康对照组血清与血浆样品进行分别处理，将洗脱下来的多肽样品溶液移入干净的0.5ml样品管，以备质谱检测。

1.5 质谱检测方法

在MALDI靶面上先点1μl洗脱样品，室温放干后再点 1μl基质(3mg/ml CHCA，50%ACN，2%TFA)，室温放干。放入 AutoflexⅢ MALDI-TOF/TOF质谱检测，条件如下:SmartBeam TM激光源，波长355 nm，正离子模式，扫描相对分子质量范围1000～10000，激光能量36%，每个样品叠加1000张谱图。

1.6 生物信息学处理

质谱数据通过 FlexAnalysis 3.0进行基线的平滑、去背景、标峰处理，再通过ClinProTools软件进行峰面积归一化和统计分析。

2 结果

2.1对磁珠结合质谱检测血液蛋白多肽方法的重复性观察

表1显示，对经过WCX磁珠提取处理的同一慢性心衰气阴虚证患者血浆样品进行了8个时间点的检测，选择高、中、低分子量3个范围内的10个峰，以质谱峰下面积为强度，计算变异系数进行重复性评估。样品变异系数范围在6.65% ～20.62%，重复性较好。

2.2 不同样品与基质配比对质谱结果的影响

选择慢性心衰气阴虚证患者经过WCX磁珠提取的血浆样本与质谱基质按照 0.2/1、0.4/1、0.6/1、0.8/1、1/1 5种配比比例，分别检测获得样品基质不同配比的质谱图。结果显示，在适当范围内改变样品与基质比例对结果无影响。

2.3 反复冻融对血液多肽的影响

取慢性心衰患者的同一血浆样本反复冻融5次，分别进行IMAC-Cu磁珠提取后检测多肽的质谱图。实验结果显示，无论在出峰数量还是峰的强度等方面，反复冻融5次之内没有显著差异。

表1 血浆质谱检测的重复性考察

2.4 血液不同采集方式和提取方法质谱差异比较

表2显示，分别检测慢性心衰气阴虚证组和健康对照组经IMAC-Cu、WCX磁珠处理的血浆组、血清组样品，分析血液不同采集方法和不同磁珠试剂盒提取的血液多肽质谱差异。结果显示，慢性心衰气阴虚证组和健康对照组在相应检测范围内，经IMAC-Cu磁珠提取后获得的血清质谱峰分别为65、68个，而血浆则为39、32个;经WCX提取后获得的血清质谱峰分别为75、82个，而血浆则为47、79个。结果显示，无论是患者还是健康志愿者，不同磁珠处理方法得到的血清样品的平均质谱峰数量均多于血浆的质谱峰数量;而不同血液处理方法中，WCX磁珠提取血液多肽获得的质谱峰情况多于IMAC-Cu磁珠处理方法。

表2 不同血液处理和磁珠提取方法的质谱出峰情况

2.5 慢性心衰气阴虚证与健康对照组间血液多肽质谱图初步比较

图1显示，对于相同血液处理和磁珠提取的慢性心衰气阴虚证组和健康对照组间血液多肽比较显示，2组间质谱峰数量接近，但其血液蛋白质谱有明显差异，如IMAC-Cu提取的患者组与健康对照组的血清质谱二维分布图中，质荷比为7766Da的质谱峰在2组样品中的峰强度有明显差异;初步分析后显示，根据差异表达蛋白可以很好区分2组间差异。

3 讨论

图1 IMAC-Cu磁珠提取的患者与健康志愿者血清/血浆二维分布图

近年来，不少中医药工作者利用双向电泳、液相色谱等蛋白质组学技术进行了中医证候的探索研究［1、2］，然而由于这些技术在重复性、灵敏性、高通量等方面仍有很多问题，影响了其在临床中的应用与推广。最近几年来研究发现，基于磁珠提取的MALDI-TOF-MS技术在发现潜在的生物标志物、识别复杂反应的蛋白质组指纹图谱方面成效显著［3-7］，是目前蛋白质组研究中发展最快、最具活力和潜力的质谱研究技术之一，具有高通量、高精确、能够进行快速分离、制备和鉴定的特性，非常适于中医证候体系的复杂蛋白质表达模式获得以及比较分析。本实验建立了磁珠法结合 MALDI-TOF MS进行慢性心衰气阴虚证血液蛋白质组学研究的实验方法，为中医证候蛋白质组学研究提供了新技术参考。

首先，重复性研究显示，采用峰面积作为相对强度得到的样品变异系数范围在6.65% ～20.62%之间，根据以往文献［8-11］报道的11% ～30%、3% ～33%，在可接受范围内，说明重复性较好。在进行血液样品的前处理时，反复冻融5次之内，无论在出峰数量还是峰的强度等方面，质谱出峰情况没有显著差异。但由于反复多次冻融血液样品易造成蛋白质及多肽沉淀，从而导致质谱丢失部分蛋白及多肽，因此尽量避免反复冻融不超过3次为宜。

在质谱分析过程中，样品与基质的比例对质谱信号有很大影响。本研究显示，血浆样本与基质选择 0.2/1、0.4/1、0.6/1、0.8/1、1/1 5 种配比比例，质谱图未见差异，因此在适当范围内改变样品与基质比例对结果无影响。

本研究显示，基于不同的血液处理方法，血浆和血清的蛋白质谱图存在很大的差异:两种磁珠提取方法获得的血清质谱信号数量均高于血浆，这与凝血过程涉及激肽、补体、多种因子的释放等有关;目前大多数蛋白质组学研究采用的是血清标本，但越来越多的学者主张为反映机体体内的实际情况最好采用血浆，只有在抗凝剂干扰检验结果的情况下，才考虑采用血清［12-14］。当前仍没有足够的证据支持蛋白质组学研究中应该选择血浆或是血清作为研究材料，因此在研究中若将血清和血浆进行平行对比和印证分析，可以增加结论的可靠性。

在蛋白质分离提纯中，具有不同的化学和生物学表面修饰的磁珠能被不同的蛋白质识别和可逆结合，选用哪种磁珠进行分离对研究结果的影响也很大。我们的实验结果显示，通过弱阳离子磁珠提取获得的血液质谱信号要多于铜螯合磁珠，表明弱阳离子磁珠可以从样品中筛选出更多的蛋白质，为寻找到CHF气阴虚证差异蛋白质提供了更大的可能性。具体研究中可以根据实验研究目的的不同，如为了分离尽可能多的蛋白还是仅仅分离样品中某些感兴趣的蛋白，来选择合适的磁珠试剂进行提取。

磁珠结合MALDI-TOF质谱技术检测血液蛋白及多肽谱的整个实验体系稳定、可靠、重复性好，适用于中医证候蛋白质组学的研究。

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