cTnI、Mb联合应用评价异丙肾上腺素诱导的心肌缺血损伤及凋亡发生

袁 瑾,李娜娜,李文花,鲜春波

(遵义医学院附属医院检验科,贵州遵义 563003）

心肌缺血性损伤,特别是急性心肌梗塞(AMI）是严重威胁人类生命的主要疾病之一,肌酸激酶(CK）、肌酸激酶同工酶(CK-MB）一直是诊断急性心肌梗塞(AMI）的重要指标,尤其是CK-MB常作为诊断(AMI）的“金指标”[1],但CK、CK-MB的测定存在诊断特异性差、早期诊断灵敏度不高、诊断窗口时间短等不足。血清肌钙蛋白I(cTnI）是心脏的结构蛋白,由于它在个体发育的各个阶段均不在骨骼肌中表达,使其成为心肌损伤最敏感、。最特异的血清标志物之一,具有诊断窗口期宽、诊断阈值明确及测定快速等优点,目前认为cTnI是检测心肌损伤的理想指标[2]。血清中的肌红蛋白(Mb）来自骨骼肌或心肌组织的损伤。是一种相对分子质量为18×103的蛋白,在心肌坏死的早期释放入血,Mb诊断AMI的早期敏感性高、快[3]。Mb在血中出现时间早与其分子量很小、能迅速自缺血损伤部位释放进入血液循环有关,助于超急性期入院患者和溶栓后再灌注的及时诊断[4]。本研究用异丙肾上腺素制造大鼠心肌缺血模型,通过对cTnI和Mb的检测并与CK、CKMB对比,来反映心肌缺血的程度,对其敏感性和特异性做出评价,同时检测缺血时心肌细胞的凋亡现象,观察细胞凋亡对心肌缺血的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象健康Wistar大鼠32只,雌雄不限,体重约150 g,由遵义医学院实验动物中心提供,随机分为4组;正常对照组(腹腔注射生理盐水10 mg/kg即第1组）、低剂量组(腹腔注射盐酸异丙肾上腺素5 mg/kg即第2组）、中剂量组(腹腔注射盐酸异丙肾上腺素10 mg/kg即第3组）、高剂量组(腹腔注射盐酸异丙肾上腺素2 0mg/kg即第4组）。

1.2 试剂cTnI测定试剂盒(美国ADA公司）,Mb测定试剂盒(美国ADA公司）,CK、CK-MB测定试剂盒(日本奥林巴斯公司）,盐酸异丙肾上腺素(上海禾丰有限公司）,细胞凋亡试剂盒(博士德）,DAB显色试剂盒(博士德）。

1.3 心肌缺血大鼠模型的建立按5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg计算每组大鼠所需注射盐酸异丙肾上腺素的量 ,别为 1.5 ml、3.0 ml、6.0 ml,正常对照组按10 mg/kg注射生理盐水3.0 ml。注射后16小时做心电图观察,出现ST段明显抬高,表示心肌梗塞大鼠模型复制成功,将典型心电图保存。各组大鼠摘眼球取血3 ml左右,置于普通试管中,以3 000 rpm的速度离心10 min,取血清-20℃保存。

1.4 方法cTnI与M b的检测采用酶联免疫(ELISA）法;CK、CK-MB用奥林巴斯AU2700生化分析仪检测血清中CK、CK-MB的含量;细胞凋亡的检测:制备石蜡切片,进行免疫组化染色,选取相应部位,细胞计数在100倍高倍视野,用标准的10×10目镜栏珊计数,共计数10个视野,结果以阳性细胞数占细胞总数的平均百分比表示。操作按试剂盒说明书进行。

1.4 统计学处理数据用SPSS11.0软件进行统计学处理,均数以 ¯x±s表示,组间比较用q检验。

2 结果

2.1 大鼠心肌缺血模型的制造腹腔注射不同剂量(5、10、20 mg/kg）盐酸异丙肾上腺素的大鼠,其心电图的ST段明显抬高,表明大鼠腹腔注射不同剂量的酸异丙肾上腺素后,发生了不同程度的心肌缺血,而且随着剂量的增大,大鼠心肌缺血越严重并出现梗塞,说明模型建立成功。急性心肌梗塞的坏死型Q波深度大于同一导联R波的1/4,宽度≥0.04秒。

2.2 cTnI、Mb与 CK、CK-MB的检测见表1。

表1 心肌缺血大鼠血清中 cTnI、Mb的含量,及与 CK、CK-MB比较

2.3 心肌细胞凋亡检测结果

2.3.1 免疫组化染色结果 对照组未见棕黄色凋亡颗粒,低剂量组可偶见。中剂量组可见到大片明显的棕黄色颗粒,并在心肌组织中分布较均匀,高剂量组的棕黄色颗粒颜色加深且聚集成团。

2.3.2 小血管表现 在检测中我们发现小血管的内皮细胞在中高剂量组可见到明显的凋亡,横切面上棕黄色颗粒呈连续性的环状排列。在小血管周围的心肌组织中也散在分布有棕黄色凋亡颗粒。

2.3.3 凋亡细胞计数结果,见表2。

表2 心肌缺血模型大鼠心肌细胞凋亡(±s,n=10）

表2 心肌缺血模型大鼠心肌细胞凋亡(±s,n=10）

注:与对照组比较,*P＜0.05

组别 剂量/mg◦kg-1 凋亡细胞百分率/%空白对照组 0 0.5±0.76低剂量模型组 5 mg/kg 5.13±2.53*中剂量模型组 10 mg/kg 5.63±1.60*高剂量模型组 20 mg/kg 10.00±3.63*

3 讨论

肌钙蛋白(troponin,Tn）由3种亚基组成,是横纹肌收缩的调节蛋白[5],其中TnC为Ca2+结合亚基[6],TnT为原肌球蛋白结合亚基[7],TnI为抑制亚基[8],心肌肌钙蛋白I具有高度的心肌特异性,相对于两种骨骼肌亚型约有40%的不同源性,其氨基末端比慢骨骼肌亚型(sTnI）多31个氨基酸残基[9]是心肌损伤最特异、敏感的标志物之一。本研究观察了大鼠发生不同程度的心肌梗塞后血清中cTnI、CK、CK-MB蛋白的变化,结果发现在大鼠心肌受损的各个阶段,血清中cTnI的含量均明显升高,升高的倍数均大于CK、CK-MB,表明在心肌梗塞各个阶段检测血清中cTnI的含量,其灵敏性均高于CK、CK-MB。

Mb分子量小并且直接接触于细胞膜,对膜通透性改变反应灵敏,膜破裂后能迅速逸出细胞。但Mb并非心肌所特有,如同时伴有肌肉损伤和肾衰时,最好于发病后4-6 h再次同时检测Mb与cTnI,以作鉴别诊断。本研究中Mb随心肌缺血严重程度的加深而升高,与CK、CK-MB相比,各组间数值差异明显,敏感性较强,与cTnI结合表现除较好的特异性。

凋亡是有核细胞在一定条件下通过启动内部机制,主要表现为内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞自然死亡过程[10]。然而心肌细胞同样存在凋亡现象,缺血性心肌细胞死亡的方式之一就是细胞凋亡。细胞凋亡先于细胞坏死出现,在缺血早期心肌细胞主要是通过凋亡的方式丧失的,是心肌缺血早期细胞死亡的主要形式[11]。心肌细胞凋亡不仅是扩大心肌梗死范围的一个独立因子,而且参与到梗死的病理过程。我们的研究发现,随着异丙肾上腺素剂量的增大,心肌细胞凋亡的程度逐渐加深。我们把每张切片取10个视野,分别计数每个视野中所有的细胞数及调亡的细胞数,然后计算调亡细胞指数(apopototic index AI）。AI=10个视野调亡细胞总数/10个视野计数细胞总数×100%。随着异丙肾上腺素剂量的增大,调亡指数逐渐增大(见表2）。而异丙肾上腺素剂量越大,心肌细胞缺血越严重,调亡指数又是反映细胞调亡程度的指标。因此表2说明随着心肌缺血程度的加重,大鼠心肌细胞调亡也随之加深。实验中还发现小血管凋亡现象明显,怀疑血管内皮细胞在缺血情况下凋亡明显,可能会在早期影响心肌细胞供血,可能是细胞坏死凋亡的原因之一,是否可能导致其他一些情况发生,还需进一步研究。

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