超声激活血卟啉对癌性胸腔积液小鼠的临床意义的实验研究

钱东华,钱 明,李 洋,吕晓红*

(1.吉林大学第一医院呼吸内科,吉林 长春 130021;2.吉林大学口腔医院）

癌性胸腔积液是临床常见的呼吸系统疾病,目前临床上没有一种确切而有效的方法治疗此病。本实验研究是为寻找治疗癌性胸腔积液的更有效的方法,为患者解除痛苦,延长寿命。血卟啉(hematoporphyrin,HP）是提取自血液的一种有机光敏物质,由于HP类化合物与癌细胞蛋白结合或被癌组织的巨噬细胞吞噬,且癌组织血管的高通透性等原因,该类化合物能够在肿瘤组织中选择性潴留,同时也可被电磁辐射激活,在肿瘤组织内诱发一系列的氧化反应,从而杀伤癌细胞起到治疗作用。目前国内外少数学者已有对超声激活HP对腹水瘤细胞研究,且证实超声激活HP对腹水瘤细胞有杀伤作用,而对癌性胸腔积液的治疗作用尚无人研究。本实验拟进行体内试验。寻找癌性胸腔积液治疗的更优化的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

Lewis肺癌细胞株,吉林大学中日联谊医院中心研究室保存;C57BL/6纯系小鼠,购于吉林大学基础医学院动物室;血卟啉二盐酸盐,粉剂Sigma公司产品;小牛血清,杭州四季青;1640培养液,GIBCO公司出品;MTT DMSO,Sigma公司产品;超声仪 Aloka5500产自日本。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏、培养、传代、冻存 Lewis均为贴壁细胞,从液氮取出冻存的细胞后立即置于37℃水浴中溶解。1 000 r/min离心5min,弃上清加入1640培养基离心洗涤一次。加入含10%1640培养基5 ml悬浮起细胞后置于25 ml细胞培养瓶中,37℃、5%CO2孵箱过夜,次日更换一次培养液,以后常规每3-4天更换一次培养液,待细胞长至80%-90%融和时,弃去培养基,加0.25%胰酶500 μ l 37℃消化3 min后,加入5 ml培养基吹打成单细胞悬液于1∶3传代分装培养或冻存。

1.2.2 血卟啉二盐酸盐(HP）及细胞悬液的配制①用1640培养基将血卟啉二盐酸盐(HP）配成5 mg◦L-1、10 mg◦L-1、20 mg◦L-1浓度溶液;②取细胞悬液,在细胞计数版上计数,用1640培养基调节细胞数至2×105/ml。

1.2.3 癌性胸腔积液动物模型的制备 ①取生长状态良好的约80%-90%融合的Lewis细胞,收集细胞并计数,用生理盐水重悬成2×106个细胞/100 μ l,立即 进行 接种,取 100 μ l细 胞悬 液皮 下注C57BL/6小鼠背部皮下,约7天左右开始成瘤,待生长至最大直径达到1-2 cm后,再进一步造模;②制备单细胞悬液:取生长良好Lewis细胞荷瘤小鼠,在无菌条件下剥离肿瘤细胞,剔除血块、脂肪,从中心剖开,观察生长情况。取生长良好,没有明显中心坏死的肿瘤组织,并用PBS反复冲洗。用无菌剪刀剪切为2mm见方的肿瘤组织,然后放人无菌细胞研磨器中,加生理盐水2-4 ml,研磨为细胞匀浆,筛网过滤后用加生理盐水2-4 ml,放人离心机800转/分,离心10min反复2次。用Trypan Blue拒染法确定细胞活力,要求活细胞在95%以上,调整活细胞数为1×106/ml。;③模型制备:取雌性、4-5周龄、体重 14-18 gC57BL/6纯系小鼠,用26号细针通过第5肋间向每只小鼠右侧胸腔注入单细胞悬液0.2 ml。

1.2.4 实验分组及治疗 取雌性、4-5周龄、体重14-18 g的造模后的C57BL/6纯系小鼠40只,其中10只为健康对照组,其余30只制备完癌性胸腔积液动物模型后,随机分成3组,分别为A:血卟啉(HP）治疗组:HP浓度为10 mg◦L-1,腹腔注射0.2 ml、分别于第 1、3、5、7 天行超声照射。B:顺铂(DDP）组、按照6 mg/kg剂量给小鼠腹腔注射0.2 ml DDP,分别于第 1、3、5、7 天各一次,共 4 次;C:生理盐水治疗组:小鼠腹腔注射0.2 ml生理盐水,分别于第 1、3、5、7 天各一次,共 4 次 ;D:健康对照组:10只以同等重量的未接种肿瘤的裸小鼠作为健康对照组。以上小鼠均在无菌清洁地方饲养。温度控制在25±2℃。

1.2.5 观察指标 治疗3周期间观察小鼠基本生存情况如呼吸、皮肤颜色、运动等情况。

小鼠体重 造模后每日在固定时间用电子称测量每只小鼠的体重,精确到0.01 g,资料存人EXCEL备检验。

小鼠摄食每日上午8-9时定量给予每组小鼠饲料,24 h测量盒内剩余的饲料量,计算小鼠的饲料摄取量,精确到0.01 g(饲料摄取量=前1天饲料重量-次日测得饲料量）。

癌细胞浸润范围实验结束后解剖三组动物,观察癌细胞在胸腔浸润范围(肺、胸膜、纵隔淋巴结、心包 、肝 、胃 、腹腔淋巴结）。

生存期 从接种瘤细胞的第一天起开始计算观察动物的生存时间。

1.2.6 统计方法 所有数据存入计算机EXCEL,用SPSSl0.O软件根据资料性质,分别采用参数或非参数等级资料比较法,计算各组统计学差异性。

2 结果

2.1 小鼠体重

全部小鼠体重在第一周都有不同程度地上升,随着时间的推移,肿瘤生长,小鼠的体重和对照组比较明显降低。在第8天体重和对照组出现明显差异。在第10天左右,实验组小鼠体重有所恢复,和对照组体重相比出现差异。随着治疗的继续,到15天两者体重在统计学上有非常显著差异(P＜0.001）。从第8天起血卟啉(HP）治疗组与健康对照组一直存在差异,说明治疗不能使体重完全恢复。DDP组和生理盐水治疗组体重曲线重叠,但是到达25天后DDP组出现体重恢复,但是没有统计学差异。这可能和治疗后无效死亡有关(图1）。

图1 各组小鼠体重变化

2.2 小鼠摄食比较

血卟啉(HP）治疗组在治疗前和其他接种组没有差异,治疗3天后,摄食较生理盐水组、顺铂组提高,随着治疗时间延长,食物摄取逐步提高,当治疗到第10天,较生理盐水组提高约25%,累积食物摄取曲线出现明显分离,统计学处理有非常明显差异(P＜0.001）(表2）。

表2 治疗后第10天每组小鼠摄食比较(单位:g,±s）

表2 治疗后第10天每组小鼠摄食比较(单位:g,±s）

健康对照组、HP组分别和其他各组比较P值都＜0.01

分组 n x— ±s P 值生理盐水组 10 44.400 5±4.801 2健康对照组 10 55.152 7±5.972 1 0.000 DDP组 10 41.463 5±9.256 0.087 HP组 10 50.584 2±5.336 5 0.000

2.3 各组动物生存状况和胸腔癌细胞浸润范围

各组动物造模后第10天开始,陆续有动物出现呼吸困难,以生理盐水对照组明显,发生数量较多,HP组和DDP组发生数较少,动物懒动,皮肤颜色较健康对照组发暗,造模后第20天三组大部分动物都发生呼吸困难,皮肤发绀,消瘦明显,动物倦卧懒动。但HP组的发生数量和程度都轻于其他两组。胸腔癌细胞浸润范围评价标准:无转移者为(-）;有1-3个转移结节者为(+）;3个及以上者为(++）。解剖胸腔发现,三组动物都有胸腔转移,大多转移到心包、肺、纵隔胸膜、纵隔淋巴结,但所有动物在腹腔都没有发现转移灶。根据转移的多少衡量转移的程度,经Ridit分析,HP组与生理盐水对照组比转移到心包、肺、纵隔淋巴结的程度有显著性差异(P＜0.05）;HP组与DDP组比无显著差异(P＞0.05）。

2.4 生存期

三组动物的中位生存时间,生理盐水对照组为31天,DDP组为36天,HP组为43天。HP组中位生存时间明显长于顺铂治疗组(P＜0.01）,说明HP治疗能延长模型小鼠的生存时间。

3 讨论

癌性胸腔积液是临床常见的呼吸系统疾病,目前临床上没有一种确切而有效的方法治疗此病。

血卟啉(hematoporphyrin,HP）是提取自血液的一种有机光敏物质,由于HP类化合物与癌细胞蛋白结合或被癌组织的巨噬细胞吞噬,且癌组织血管的高通透性等原因,该类化合物能够在肿瘤组织中选择性潴留,同时也可被电磁辐射激活,在肿瘤组织内诱发一系列的氧化反应,从而杀伤癌细胞起到治疗作用。

Date M,等[1]研究发现,HP被激活后作用靶位除了细胞膜系统外,还可诱导细胞凋亡。国内研究也证实了HP被激活后通过诱导凋亡对体外培养的人肺腺癌细胞系A549产生杀伤作用[2]。

Umemura et al.提出,并初步证明超声不仅能激活血卟啉,且具有抗癌效果,这种方法称为声动力疗法(Sonodynamic therapy,SDT）。国内外少数学者已有对超声激活HP对腹水瘤细胞研究[3-4],且证实超声激活HP对腹水瘤细胞有杀伤作用,而对癌性胸腔积液的治疗作用尚无人研究。这一新型的肿瘤治疗方法将逐步过渡到临床,使之成为有效治愈肿瘤的新疗法。

超声激活血卟啉在治疗小鼠的癌性胸腔积液的方面我们首次做了一定的工作,从研究结果发现超声激活血卟啉能对癌性胸腔积液小鼠体重的下降有控制作用,抑制肿瘤细胞的扩散,改善癌性胸水小鼠的摄食状态,提高小鼠的生存期,超声激活血卟啉在治疗胸腔积液的同时对胸痛、呼吸困难也有明显的缓解作用,能够提高小鼠的生活质量。此实验有待于进一步应用临床工作中,给癌性胸腔积液的病人带来光明。

[1]Date M,Fukuchik,Namiki Y,et al.Therapeutic effect of photodynamic therapy using PAD-S31 and diode laser on human liver cancercell[J].LiverInt,2004,24(2）:142.

[2]孙燕妮,李强,姚小鹏,等.光动力疗法对人肺腺癌细胞系A549杀伤作用的研究[J].中国肺癌杂志,2004,7(5）:396.

[3]Umemura K,Yumita N,et al.Sonodynamically induced antitumor effect of pheophorbidea[J].Cancer Lett,1996,102(1-2）:151.

[4]Liu,Q.H.,et al.Study of cell killing on S180 by different intensity ultrasound activate hematoporphyrin derivatives[J].Science in china(Scries C）,2002,32(5）:454.