多重PCR在沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染诊断中的应用

李咏梅

(淄博市临淄区人民医院检验科,山东淄博 255400）

现在全球最常见的公共卫生问题中,食源性疾病排在首位,其主要原因是食品污染,主要病原菌有沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌[1]。因此,为了快速的、有效地检测出病原菌,减少或预防食源性疾病的发生,临床工作者和检疫部门研究出效率更高的多重PCR检测法。多重PCR检测法是一种更优于PCR的特殊技术,在同一体系中可以加入多种引物,并对多个待检基因进行扩增,检测多种病原体也只需一次PCR反应,因此,在鉴别诊断混合感染时多重PCR技术具有更加方便、快捷、高效率的优势[2]。本文中,我们就多重PCR在沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染诊断中的应用效果进行观察,并将结果总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

将2009年3月-2010年3月来我院进行诊治的100例感染患者中采集的的沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为研究对象,将其分作两份。将所有菌株接种在营养琼脂斜面,在37摄氏度环境中培养18 h,进行3次转接后备用。

1.2 方法

将培养好的备用菌,即沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各1 ml、以密度为10 cfu/ml同时分别加入制备好的培养液中,在37摄氏度环境中,150 r/min的速度进行18 h的振荡培养。选用平板计数法,将培养后的增菌液1ml以10倍梯度用无菌生理盐水进行稀释,用Baird—Parker平板和WS平板计数。多重 PCR检验方法:取 1.0 ml增菌液,以14 000 r/min的速度离心5 min,在沉淀中加入1.0 mLTE清洗30 s,继续离心5 min,当超纯水中溶解后,进行15 min沸水浴,然后快速给予5 min冰浴,以12 000 r/min的速度离心,为时3 min,取上清10 μ l作为PCR反应模板。将大肠杆菌 0.5 μ l、金黄色葡萄球菌 1.0 μ l和沙门菌 0.5l μ l及模板 10 μ l,补超纯水至25 μ l。PCR循环参数为:达 94摄氏度预变性7 min,温度为94摄氏度时变性30 s,55摄氏度时退火30 s,72摄氏度时延伸30s,共循环30次;最后在72摄氏度环境下延伸5 min。然后取PCR产物8 μ l与溴酚蓝2 μ l混匀,在100V 电压下用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳30 min,将其分别放置在凝胶成像系统中,分析结果。另一份进行普通PCR检测法。后将两种检测方法的检出率、敏感性和特异性进行统计及比较。

1.3 评价标准

对两组细菌的检出率、敏感性、特异性进行统计整理。

1.4 统计学处理

将文中统计及检测所得数据采用统计学软件SPSS14.0进行相关处理,计数资料进行 χ2检验,P＜0.05表示有显著性差异。

2 结果

将两组细菌的检出率、敏感性和特异性进行统计、比较,结果见表1。

表1 两组细菌的检出率、敏感性和特异性比较(n=100）

由表1可见,多重PCR组的检出率、敏感性和特异性均高于普通PCR组,P＜0.05,有显著性差异。

3 讨论

历年来,我国对食源性疾病缺乏正确的认识,在此方面的研究也少之又少。因此,对于这种日常生活中比较常见的疾病原因和发病情况不甚了解。由于食品是否安全关系到消费者的健康,食源性疾病成为食品安全的首要问题。为了更有效的控制和预防食源性疾病的发生,应对容易被食源性致病菌污染的相关食品进行多次认真监测,尽量杜绝污染源,切断污染环节。因此,食源性疾病不容忽视,还需检测部门提供相关的检测结果,根据该结果配合制定有效的公共卫生条例[3]。由于食用不洁食物而引起的疾病在临床上屡见不鲜,在我国,污染食物的病原菌中,最常见的是沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。沙门菌可以导致败血症、伤寒及胃肠炎等疾病。食用被金黄色葡萄球菌污染的动物性食品可引起食物中毒。大肠杆菌在自然界中几乎随处可见。而且临床常出现这3种病原菌同时感染,因此,快速、有效地检测出这些病原菌可以更好的控制疾病传播[4]。目前检测这些病原菌的方法是普通PCR检测法。该技术的最大缺陷就是一次只能扩增一个片段基因,如果感染的病菌不止一种时,需要集中甚至几十个PCR反应。近年来,检测部门开始应用一种新的分子生物学技术,该技术可以在一个PCR体系里进行多种目的基因条带的扩增,可以节约时间和试剂的优点[5]。该项技术克服了传统PCR的固有缺陷,具有兼容性好、特异性强、敏感性高、高效性的优点[6]。此外,呼吸道感染病菌也是临床常见病症,一般感染的病菌有细菌、病毒、衣原体及支原体等,使诊断和治疗疾病出现不同程度的困难。而使用多重PCR技术保持了较高的敏感性和特异性,同时检测多种致病菌,而且耗时短,给临床医师提供了相应的参考,减少误诊现象,满足了临床对呼吸系统疾病的诊治要求[7]。但需注意的是,由于多重PCR需在同时进行几条甚至几十条引物的反应,如设计不合理,也有可能降低其反应敏感度,使检测结果出现差错,因此,该技术对实验条件比较苛刻,临床诊断疾病时,还应结合其他临床资料及诊断方法。尽管如此,多重PCR技术在临床诊断中仍具有重要的意义。由本文可见,多重PCR技术组在沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染的诊断中,其检出率、特异性和敏感性均高于普通PCR技术组,因此我们认为多重PCR技术组在沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染的诊断中应用效果好,值得推广应用。

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[4]许一平,成 炜,邵彦春,等.沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测[J].微生物学通报,2006,33(6）:89.

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[6]韩卫宁,韩 健.分子鉴别诊断领域的革命性技术——Tern-PCR[J].细胞与分子免疫学杂志,2009,25(2）:184.

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