卵巢恶性肿瘤标志物-CA125微柱凝胶免疫检测方法的建立及评价

方红娟,蔡智天,钟 磊,潘 颖,宋 波,杜 博

(1.吉林大学第四医院 电诊科,吉林 长春 130011;2.吉林大学第一医院生殖中心,吉林 长春130021;

3.吉林大学中日联谊医院骨科,吉林 长春130033;

4.吉林大学中日联谊医院 妇产科,吉林 长春130033;5.吉林省肿瘤医院 核医学科,吉林 长春 130012）

卵巢恶性肿瘤(Ovarian malignant tumor）是危害妇女生命和健康的主要疾病,而在卵巢恶性肿瘤的病理类型中,卵巢上皮性恶性肿瘤最多,死亡率亦最高,如果对卵巢恶性肿瘤能够做出早期诊断,可使患者的长期生存率得到显著提高。有研究表明,卵巢上皮性恶性肿瘤的血清特异性标志物为CA125[1]。

微柱凝胶技术,是近年来在国外很多先进血液免疫实验室得到大力推广的一种新的检测技术,作为一种新型定性的检测方法,它具有较高的检测灵敏度[2,3],已在临床应用于多项疾病的早期筛查和诊断[4]。

目前临床多采用化学发光免疫分析法检测患者血清CA125的表达作为早期筛查卵巢恶性肿瘤的方法,与该方法相比,微柱凝胶技术具有操作简单、省时、敏感性高、结果易保存等优点[5,6],有很大开发利用价值。微柱凝胶技术用于卵巢恶性肿瘤标志物CA125的检测,目前国内外均未见报道。本研究应用微柱凝胶的检测原理,根据患者病理诊断选取265例正常妇女及232例卵巢上皮性恶性肿瘤患者作为研究对象,检测血清中CA125的表达情况,并与化学发光免疫分析法检测结果进行对比,探讨微柱凝胶法检测卵巢恶性肿瘤标志物CA125对卵巢恶性肿瘤的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集吉林大学中日联谊医院、长春市妇产科医院和吉林省肿瘤医院2007年4月至2009年1月间妇科住院患者血清标本,均有完整的临床资料。患者年龄在15-77岁之间,平均年龄46岁。

1.2 标本收集及处理抽取静脉血约3 ml,离心机12 000 r/min分离血清,取上清液置-20℃保存。

1.3 入选病例的观察及分组卵巢上皮性癌(Ⅰ-Ⅱ期）及卵巢上皮性癌(Ⅲ-Ⅳ期）232例,所有卵巢恶性肿瘤患者均未合并其他恶性肿瘤,正常妇女血清265例。分别应用微柱凝胶法及目前临床应用的化学发光免疫分析法检测血清中CA125的量。所有研究对象均有病理诊断。

1.4 主要试剂及实验方法兔抗CA125IgG(生物素标记）、羊抗兔IgG、亲和素购自北京博奥森生物技术有限公司;微柱凝胶免疫分析技术专用离心机和孵育器由长春博研医学生物仪器公司生产;MGCoombs'试剂卡由长春博讯生物技术有限公司提供。仪器:离心机(德国生产）,振荡器(水浴恒温）(江苏金坛市金成国胜试验仪器厂）。化学发光免疫分析试剂由CH IRON公司提供,液相试剂为标记吖啶酯的M 11单克隆抗体。固相试剂为包被在磁粉颗粒上的OC125单克隆抗体。仪器为美国CH IRON公司生产的ACS:180全自动化学发光免疫分析仪。实验方法:包括指示细胞的制备,微柱凝胶的制备。将兔抗CA125抗体稀释倍数为1∶200,指示红细胞稀释100倍,50 μ l待检血清加入微柱凝胶卡中,将50 μ l稀释的兔抗CA125抗体加入微柱凝胶卡中,置37℃恒温孵育器中30 min,将稀释好的指示红细胞50 μ l加入卡里,孵育 15 min,后置离心机离心 15 min。化学发光免疫分析法采用双抗体夹心法,分析过程采用自动化,仪器自动吸样品50 μ l,液相试剂250 μ l,固相试剂 250 μ l,37 ℃温浴 7.5 min,冲洗后,自动加入反应试剂(碱性双氧水）,激发反应,其发光强度与样品浓度呈正比。

1.5 结果判定标准观察的阳性结果以肉眼见红细胞被扣留在凝胶之间为阳性,红细胞沉淀在管底为阴性[7],+为1/4红细胞少部分被扣留在凝胶之间,2+为1/2红细胞被扣留在凝胶之间,3+为3/4红细胞被扣留在凝胶之间,4+为肉眼见红细胞全部被扣留在凝胶之间;化学发光免疫分析法按药盒上的建议＞35 U/mL为阳性值。

2 结果

本实验以病理诊断作为金标准,微柱凝胶法和化学发光免疫分析法检测卵巢上皮性恶性肿瘤血清CA125的结果,计算两种检测方法的灵敏度和特异度分别为 84.6%,88.6%和88.4%、91.3%。(见表1和表2）

表1 微柱凝胶免疫检测法检测血清CA1254的结果

表2 化学发光免疫分析法检测血清CA125结果

3 讨论

卵巢肿瘤标志物对于肿瘤的早期发现、监测,甚至靶向性治疗具有重要意义。卵巢癌肿瘤标志物研究较多的是血清CA125,血清CA125水平的确与卵巢癌的恶性程度有关,在绝经后妇女中证实有筛查卵巢癌的价值。血清卵巢癌的肿瘤标志物的检测方法有多种,如ELISA方法[8],化学发光免疫分析法测定,放射免疫技术,质谱技术,基因和蛋白质组学[9,10]等,目前临床上常用的肿瘤标志物检测方法为化学发光免疫分析法,是目前各种免疫分析中最有前途的方法之一,但此项检测仪器价格昂贵,不适于在社区或经济效益小的中小医院开展,亦不适于作为早期卵巢癌筛查的首选。Y.Lapierre[11]介绍了一项免疫学检测新技术即微柱凝胶免疫实验。该技术的本质是血凝试验,即红细胞抗原抗体在微柱腔内的凝胶介质中发生肉眼可见的免疫凝集反应。它的特点为:简单、可标准化、自动化、重复性好,一卡六管,减少标记,避免错误,所需标本量少、无须洗涤、结果稳定、易于判读。目前倾向于多种血清肿瘤标志物联合检测[12],以提高诊断的敏感度和特异度。但因本实验经费有限,本文只进行了卵巢恶性肿瘤标志物CA125的检测,未进行多种肿瘤标志物的检测,此部分将在后续的实验中进一步证实。利用其优点,本研究应用微柱凝胶的原理,检测卵巢恶性肿瘤标志物CA125的水平并与化学发光免疫分析法进行比较。

本研究显示,微柱凝胶检测方法检测灵敏度、特异度更接近化学发光分析方法的检测灵敏度及特异度。

我们可以利用微柱凝胶检测方法简便、快捷、以及成本低的特点,可在一些经济及技术比较落后的县级及乡镇卫生医院替代目前临床常用的化学发光免疫分析法,作为卵巢恶性肿瘤早筛查、早诊断及治疗后的跟踪随访一线检测方法。为其在临床上肿瘤标志物的检测提供了更广阔的发展空间。

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