神经再生与缺血性脑卒中的研究*

蔡世昌 白 波 张秋玲

(1．泰山医学院神经生物学教研室，山东泰安 271000; 2．济宁医学院，山东 济宁 272000)

脑卒中是临床常见病和多发病，具有高发病率、高病死率、高致残率和高复发率的特点。脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中发病率占脑卒中的70% ～80%，猝死率更是高达80%以上，给人类带来极大的危害。其预后差的主要原因是脑缺血再灌注后损伤的脑组织修复不佳，至今尚无有效的方法来完全修复受损组织。减少缺血造成的脑细胞死亡级联反应和增加新的有功能的神经细胞是两个研究方向。神经干细胞(neural stem cell，NSCs)是由胚胎早期室管膜上皮产生的一种具有多向分化潜能的前体细胞。干细胞研究的迅猛发展给临床脑卒中治疗带来了巨大的机遇，一些神经性病变和应激能促进干细胞的激活。新近的研究［1～3］证实，脑缺血可以刺激机体处于应激状态，从而激活室管膜下层等部位的神经干细胞增殖分化。本文从国内外对缺血性脑卒中后神经细胞的再生、迁移、分化的最新研究进展作一综述。

1 神经干细胞的特征及在成人脑内的分布

神经干细胞存在于哺乳动物中枢神经系统内，其处于较原始的未分化状态，具有自我复制产生与父代完全一致的子代细胞的能力，并且可以多向分化，演变成不同类型的神经细胞。传统观念认为神经元只在胚胎期增殖，成年个体的神经元是终末细胞，不再具有分裂能力。20世纪末，有学者首次提出中枢神经系统内存在神经干细胞的概念，并证明它能分化成三种神经细胞，从而为神经系统的研究开辟了一个全新的领域。目前已证实成年哺乳动物中枢神经系统内终身存在神经干细胞，其不断进行少量有丝分裂进行自我复制以补充丢失的神经细胞。在成年哺乳动物脑内的海马、脑室下区、大脑皮质、大脑脉络丛、室管膜、纹状体和嗅球等地方都有神经干细胞;而以侧脑室的室管膜下层(subventricular zone，SVZ)和海马齿状回的颗粒下区(subgranular zone，SGZ)两个区增殖能力最强。

2 NSCs再生规律及影响因素

正常生理情况下，哺乳动物体内的神经干细胞非常少，基本可以认为其处于静息状态。但神经生发中心一直存在，在病理状态下诱发其增殖。然后再沿着特定的通路向所需部位迁移，在其周围微环境的影响下分化成特定神经细胞。神经干细胞的再生、增殖、分化和迁移在时间上和空间上是一个同步协调的过程，最终是否分化成为有功能的正常神经细胞受很多因素的影响。哺乳动物的种属、性别、年龄、遗传和饮食都是影响因素之一，还有脑内微环境中的神经递质、细胞因子、激素水平、神经生长因子等也都参与了神经元再生过程的调节。其中神经因子和激素对再生神经细胞的影响发展最为迅速。之前已经确认表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)注入动物脑室内能明显增加室周区内细胞的增殖和增加SGZ神经胶质细胞分化成熟的比例，但不增加成熟神经元的比例;碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)则可以使新生小鼠脑内新生神经细胞数增加;脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)也可以使小鼠脑室内和嗅球新生神经元的数量增加，但高水平的BDNF表达抑制其向神经元分化。国内外有大量的研究证实激素对NSC分化的调控有显著的影响。在神经系统的发育过程中，生长激素能够促进神经元和神经胶质细胞的增殖;雌激素通过其受体(ERs)影响神经细胞的迁移和分化，一些中枢神经系统产生的内源性雌激素可以对NSC进行定向调控;甲状腺激素能调控CNS的发育，决定NSC的分化过程，甚至还能影响成年动物NSC的增殖与成熟;外源性胰岛素注射能增强视网膜NSC的可塑性;褪黑激素(melatonin，Mt)可以促使神经干细胞明显增殖，并且向神经元和神经胶质细胞分化。视黄酸(retinoic acid，RA)也可以促使神经干细胞向神经元方向分化，促进神经细胞成熟，这需要神经生长因子的参与。内源性或外源性红细胞生成素(erythropoietin，EPO)都可以促进SVZ内神经干细胞的增殖和分化;糖皮质激素(glucocorticoid，GC)则对NSC的增殖和分化起到抑制作用，以维持神经发生的平衡。

除常见的激素之外，新发现的一些激素和神经肽类激素也参与神经细胞再生的调节。Ghrelin是新发现的一种脑肠肽，其能够促进神经细胞分化。Chen 等［4］证实脂联素(adiponectin，APN)能通过抑制NF-κB(p65)的转运而起到抗炎作用，从而对脑缺血再灌注损伤起到有效的保护作用。Lauren A等［5］发现G蛋白耦联受体血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白(putative receptor protein related to the angiotensinreceptor AT1，APJ)的天然配体 Apelin能诱导Akt和Raf/ERK-1/2的磷酸化，保护海马神经元对抗 N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)兴奋性毒性损伤，作为一种内源性神经保护因子保护大脑神经细胞，Cook［6］进一步证实了这个观点。Zhang等［7］认为瘦素(Leptin)增强降钙素基因相关蛋白(calcitonin gene related protein，CGRP8-37)的表达，也可以上调bcl-2表达和抑制凋亡因子caspase-3。这些联合作用能显著的对抗脑缺血缺氧造成的损伤。盛宝英等［8］证明半乳凝素1可促进大鼠脑缺血损伤后内源性神经干细胞原位增殖，并出现向外周脑实质迁移的趋势。激肽释放-激肽系统可以通过诱导脑缺血区新生血管生成，改善脑缺血缺氧而起到脑保护作用。成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2)作为一种丝裂原促进神经干细胞的增殖分化，有效促使脑缺血后脑组织的修复［9］。总之，神经元再生受到诸多因素的影响。

3 神经干细胞治疗缺血性脑卒中的两种策略

目前，利用神经干细胞来治疗脑卒中有两种策略，一种是外源性神经干细胞移植，另一种为内源性神经干细胞的活化。

3．1 外源性神经干细胞移植治疗缺血性脑卒中

3．1．1 NSCs移植治疗研究现状

神经干细胞移植治疗脑卒中是临床研究的总领域之一，目前主要分两类，一类是直接利用移植来的神经干细胞替代损伤脑细胞。另一类是移植经过基因修饰的细胞，这些细胞整合了基因编码的细胞因子，这些因子能促进NSCs的增殖、分化和迁移。不同来源的神经干细胞进行移植已经有大量的报道。有学者把体外培养的神经干细胞移植到缺血后的大鼠侧脑室内，观察到移植的神经干细胞能迁徒到缺血区域分化为神经元细胞，从而改善大鼠的运动功能，起到替代治疗的作用。Parr等［10］采用体外培养强化绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，EGFP)标记的成年大鼠脊髓神经干细胞，再把这种神经干细胞移植到脊髓损伤部位及其头侧或尾侧1 mm脊髓内，实验显示，移植第7天病变部位以外的移植区存活细胞数量明显比其他组增多。Dasari等［11］将人脐血干细胞直接注射到大鼠模型的脊髓损伤部位。结果发现，人脐血干细胞可分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞并且损伤区轴索超微结构正常，新分化的少突胶质细胞能够分泌BDNF和神经营养因子3(neurotrophic factor-3，NT-3)，移植的人脐血干细胞还能促进髓鞘再生，这些都有效改善大鼠脊髓损伤后的运动功能。Ao等［12］证明用嗅神经鞘细胞和神经干细胞联合移植治疗神经损伤能起到良好效果，神经干细胞增殖分化新生神经细胞补充丢失的神经细胞，嗅神经鞘细胞促进髓鞘的形成并且引导轴索延长，从而能让神经细胞轴索顺利穿过胶质瘢痕尽快恢复功能。胡苏华等［13］发现脑出血大鼠脑内移植神经干细胞，在修复过程中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、层粘连蛋白(laminin，LN)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)有不同程度的表达增加。结果说明了神经干细胞移植后在局部增殖、迁移并分化成为损伤修复所需神经细胞，同时形成新生微血管，重建和改善微循环，共同构建新的神经系统统一体，最终重建具有正常功能的神经元网络。

诱导神经干细胞向具有合成某些特异性递质能力的神经元分化，目前还没有找到成熟的方法，利用基因工程修饰体外培养的神经干细胞是这一领域的重大进展;陈柏龄等［14］利用Ang-1基因修饰的兔自体骨髓基质细胞(rabbit mesenchymal stem cells，rMSCs)作为移植源细胞，迁移至脑损伤区分化为神经细胞并能较长期存活;说明MSCs移植与其分泌的Ang-1蛋白有协同作用，共同促进脑梗死后神经功能的恢复。进一步研究发现，MSCs除了能分化为间充质细胞谱系外，还能分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞与神经元。

3．1．2 NSCs移植暴露的问题

对移植治疗神经损伤来说，自体神经干细胞的来源是一大难题。Medici［15］证明血管内皮细胞转变为多能样干细胞，这就为干细胞移植来源提供了理论依据。也有学者尝试利用携带外源性基因的神经干细胞来建立永生化的中枢神经干细胞系，从而解决干细胞来源难题，但外源基因的可控性、稳定性、安全性、同源程度及与转化相关的变化尚未很好的解决。虽然目前胚胎干细胞、神经干细胞在体外培养中都可以分化为神经细胞，但是分化成人们所设计的特定神经细胞的比例并不高，而且每次人工诱导分化都会存在一定程度的差异，无法做到产出的神经细胞完全均一;并且移植的神经干细胞在形态上的成活并不标志着一定就具有了功能，因此有作者担心，将没有统一标准的并不稳定体外培养的神经干细胞直接移植给患者，可能会带来灾难性的后果。干细胞移植有可能导致肿瘤已经为多数人认同，并成为干细胞研究关注的焦点之一。理论上认为只要具有分裂增生能力的细胞植入动物体，一旦无限制的生长，就具备形成肿瘤的可能。现有研究证实成熟度相对高的神经干细胞移植后同样具有较高的致瘤性。目前有人利用自体的成熟神经细胞通过核酸重排使其具有分裂能力［16］，从而形成新的自体细胞移植源。而这种自体移植源细胞可以通过基因集成技术在神经细胞分化过程中诱导其定向分化［17］，从理论上讲有可能解决自体神经干细胞移植的相关问题。

中枢神经系统具有一定免疫源性，它通过活化的具有抗原提呈特性的淋巴细胞和小胶质细胞起作用，对外源性移植物具有排斥反应，这就使利用外源性神经干细胞移植来治疗中枢神经系统损伤受到了极大的挑战。也有学者［18］发现在神经变性疾病的神经细胞功能恢复中免疫系统和神经干细胞具有协同作用。

3．2 内源性神经细胞再生治疗缺血性脑卒中研究现状

目前已知在脑出血、脑缺血、脑外伤、癫痫和神经变性疾病等一些病理条件下会激活内源性神经干细胞分裂增殖。Liu等［19］首次证实短暂性全脑缺血可激发大脑内源性的神经细胞再生，从此掀起研究脑缺血后神经细胞再生现象的热潮。这种神经发生不是一个短暂现象，其至少可以持续4个月之久。动物实验证实一侧局灶性脑缺血后双侧SGZ和SVZ均有神经细胞再生现象，缺血侧比非缺血侧神经细胞再生明显增多，并随时间而增多，到缺血后第4周可高达93%，说明了脑缺血损伤程度直接影响神经干细胞的增殖。夹闭大脑中动脉30 min就能引起齿状回区(dentate gyrus，DG)轻度、可变的神经干细胞增殖，而夹闭2 h后则发现DG区新生细胞数明显增多，且其不依赖于海马神经元的凋亡。Zepeda等［20］研究发现，缺血性脑损伤导致兴奋性神经递质释放过度，打破了神经细胞信号系统平衡，伴随细胞骨架蛋白、NMDA受体和GABA受体表达出现改变，从而改变了神经细胞生存的微环境，导致神经元细胞凋亡。但这种变化也是大脑生发中心神经干细胞增殖和分化的重要诱因。脑缺血不但可以刺激半暗带区神经细胞的再生，还可以影响再生神经细胞的迁移。脑缺血可以促使新生的神经细胞从同侧的SVZ区向对侧受损的纹状体区迁移。这是因为巨噬细胞或小胶质细胞分泌的骨桥蛋白导致迁移线路的改变［21］。再生神经细胞迁移后的进一步分化也取得了成功。Hou等［22］在栓塞前1天的大鼠大脑中用含EGFP的逆转录病毒标记分裂细胞，观察到大鼠脑缺血28 d后，迁移至受损纹状体区段的神经干细胞分化为GABA能神经元和类胆碱能神经元。这两种神经元可逐渐形成树突，产生动作电位，并能够与损伤纹状体内原有的神经元建立突触联系。这就证明了脑缺血后SVZ区再生的神经元具备功能且能整合到原有神经回路中，与正常SVZ区神经发生过程类似。

在神经细胞信号系统方面也有重大突破。Notch1信号通路被认为是胚胎神经干细胞发育调节的主要因素，Wang等［23］观察到成年大鼠Notch1基因主要表达在新生神经元，而Notch1的配体Jagged 1主要表达在SVZ的星形胶质细胞。脑缺血4～24 h可激活Notch1信号通路NICD(notch intracellular domain)和下游转录基因Hes1、Shh，相应的SVZ区的细胞增殖，阻断Notch1信号通路也就抑制了脑缺血诱导的神经再生。说明Notch1信号通路在正常的和脑缺血诱导的神经再生中起着关键作用。Wnt家族是神经干细胞调节的另一关键信号通路。刑雪松等［24］研究发现脑缺血再灌注7 d wnt-1基因表达最强，与Brdu免疫组化结果一致。结果说明wnt-1基因在成人机体处于静止状态，脑缺血后表达，在神经干细胞早期增殖、迁移、分化中起重要调控作用。Castillo［25］也证实wnt-1信号通路在神经干细胞增殖分化中起重要作用。

4 总结与展望

综上所述，脑缺血导致神经细胞死亡成级联反应，同时也激活了静态的神经干细胞分化以对抗神经细胞的大量死亡。在脑缺血再灌注早期，新生神经细胞的增殖主要集中在双侧侧脑室的VZ/SVZ，其他脑区仅有零星的增殖细胞。局灶性脑缺血和全脑缺血都能激发神经细胞的增殖，增殖的新生神经细胞能主动向损伤区域迁移。在增殖和迁移的过程中都受很多因素的影响，目前在调控这些因素方面神经科学家们做了大量工作，取得一定效果，但没有一个统一的结论。利用外源性的神经干细胞移植也取得了很大的突破，但如何克服技术和伦理的束缚，按照预期的设计稳定的分化成所需细胞并且迁移到特定部位还没有成熟技术。内源性神经干细胞的活化治疗脑卒中较神经干细胞移植有不受伦理约束，没有排斥反应和细胞毒性，没有诱发肿瘤的危险等优势，利用神经干细胞的增殖能力在脑缺血再灌注早期就能大量的、稳定的替代损失的神经细胞，从而使临床脑卒中的危害降到最低是神经学科学家未来要做的工作。

［1］ Kuge A，Takemura S，Kokubo Y，et al．Temporal profile of neurogenesis in the subventricular zone，dentate gyrus and cerebral cortex following transient focal cerebral ischemia［J］．Neurol Res，2009，31(9):969-976．

［2］ Martí-Fàbregas J，Romaguera-Ros M，Gómez-Pinedo U，et al．Proliferation in the human ipsilateral subventricular zone after ischemic stroke［J］．Neurology，2010，74(5):357-365．

［3］ Kernie SG，Parent JM．Forebrain neurogenesis after focal ischemic and traumatic brain injury［J］．Neurobiol Dis，2010，37(2):267-274．

［4］ Chen B，Liao WQ，Xu N，et al．Adiponectin protects against cerebral ischemia reperfusion injury through anti-inflammatory action［J］．Brain Research，2009，1273:129-137．

［5］ Lauren A，O’Donnell．Apelin，an endogenous neuronal peptide，protects hippocampal neurons against excitotoxic injury［J］．Journal of Neurochemistry，2007，102:1905–1917．

［6］ Cook DR，Gleichman AJ，Cross SA，et al．NMDA receptor modulation by the neuropeptide apelin:implications for excitotoxic injury［J］．Neurochem，2011，118:1113–1123．

［7］ Zhang JY，Yan GT，Liao J，et al．Leptin attenuates cerebral ischemia/reperfusion injury partially by CGRP expression［J］．European Journal of Pharmacology，2011，671(1-3):61-69．

［8］ 盛宝英，陈雪寒，黄作义，等．半乳凝素1对脑损伤大鼠室管膜下区内源性神经干细胞原位增殖及迁移的影响［J］．中国组织工程研究与临床康复，2008，12(38):7487-7490．

［9］ Sum JQ，Sha B，Zhou WH，et al．Basic fibroblast growth factor stimulates the proliferation and differentiation of neural stem cells in neonatal rats after ischemic brain injury［J］．Brain Dev，2009，31(5):331-340．

［10］ Parr AM，Kulbatski I，Tator CH．Transplantation of adult rat spinal cord stem/progenitor cells for spinal cord injury［J］．Neurotrauma，2007，24(5):835-845．

［11］ Dasari VR，Spomar DG，Gondi CS，et al．Axonal remyelination by cord blood stem cells after spinal cord injury［J］．Neurotrauma，2007，24(2):391-410．

［12］ Ao Q，Wang AJ，Chen GQ，et al．Combined transplantation of neural stem cells and olfactory ensheathing cells for the repair of spinal cord injuries［J］．Med Hypotheses，2007，69(6):1234-1237．

［13］ 胡苏华，刘爱群，武衡．大鼠神经干细胞脑内移植治疗脑出血的实验研究［J］．神经损伤与功能重建，2008，3(3):146-149．

［14］ 陈柏龄，陈东平，张志坚，等．Ang-1基因修饰的骨髓间质干细胞移植治疗脑梗死的实验研究［J］．中国病理生理杂志，2009，25(2):241-247．

［15］ Medici D，Shore EM，Lounev VY，et al．Conversion of vascular endothelial cells into multipotent stem-like cells［J］．Nature Medicine，2010，16:1400 –1406 ．

［16］ Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto K，et al．Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells［J］．Science，2007，318:1917-1920．

［17］ Yu J，Hu K，Smuga-Otto K，et al．Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences［J］．Science，2009，324:797 –801．

［18］ Mathieu P，Battista D，Depino A，et al．The functional role of inammation on neuronal differentiation of endogenous and transplanted neural stem cells in the adult brain［J］．Neurochem，2010，112:1368 –1385．

［19］ Thored P，Arvidsson A，Cacci E，et al．Persistent production of neurons from adult brain stem cells during recovery after stroke［J］．Stem Cells，2006，24(3):739-747．

［20］ Zepeda A，Sengpiel F，Guaqnelli MA，et al．Functional reorganization of visual cortex maps after ischemic lesions is accompanied by changes in expression of cytoskeletal proteins and NMDA and GABAA receptor subunits［J］．Neurosci，2004，24(8):1812-1821．

［21］ Yan YP，Lang BT，Vemuganti R，et al．Osteopontin is amediator of the lateral migration of neuroblasts from thesubventricular zone after focal cerebral ischemia［J］．Neurochem Int，2009，55(8):826-832．

［22］ Hou SW，Wang YQ，Xu M，et al．Functional integration of newly generated neurons into striatum after cerebral ischemia in the adult rat brain［J］．Stroke，2008，39(10):2837-2844．

［23］ Wang X，Mao X，Xie L，et al．Involvement of Notch1 signaling in neurogenesis in the subventricular zone of normal and ischemic rat brain in vivo［J］．Cereb Blood Flow Metab，2009，29(10):1644-1654．

［24］ 邢雪松，吕威力．Wnt-1在大鼠脑缺血再灌注海马组织内源性神经干细胞早期增殖分化中的作用［J］．中国组织工程研究与临床康复，2007，11(3):412-418．

［25］ Castillo AB，Jacobs CR．Mesenchymal stem cell mechanobiology［J］．Curr Osteoporos Rep，2010，8(2):98-104．