植酸酶的抗逆性特点

冯定远

在动物饲粮中添加植酸酶可减少环境污染，降低饲养成本，促进动物生长发育。随着生物技术的发展，商业植酸酶制剂逐渐得到了广大用户的认可。然而，由于现代饲料加工过程中工艺环节的复杂性，植酸酶制剂的应用效果与酶制剂本身的抗逆性密切相关。不同来源植酸酶的抗逆性可能存在较大差异。在生产实际中应选择耐热性好、最适pH值范围广、能被胃肠道消化酶作用的植酸酶制剂，同时还应注意矿物元素对其酶活的影响。

1 植酸酶的耐热性

饲料加工过程中有一个高温调质过程，温度一般在75～80℃，有时温度高达85～90℃，在膨化饲料制作过程中甚至达到120℃或者更高。由于酶制剂本质大多为蛋白质，而蛋白质易受温度的影响使分子内的振动增强，从而破坏维持空间构象的次级键，有时还会使某些蛋白质中的二硫键断裂并发生二硫键交换反应，从而产生热变性；而且随着温度的升高，发生热变性的植酸酶蛋白逐渐增多，植酸酶的活性也随着迅速下降（汪玉松等，2005）。我们一般认为，酶制剂在制粒或膨化温度下通常发生的是不可逆活性损失。然而，Pasamontes等（1997）认为，植酸酶对温度的耐受性可能与其发生热变性后的构象恢复有关，高温调质时植酸酶的二级构象发生改变，冷却后这种改变的二级构象可以部分回复到适宜活性的构象，从而保持一定的酶活性，这也是目前有些耐高温植酸酶在高温处理之后仍然有较高的活性残留的原因之一。

温度对酶制剂影响的研究报道较多（李卫芬等，2001a；马合勤，2002；于旭华，2004；杨彬，2004；郑涛，2005；陈惠等，2005；左建军等，2006；冒高伟，2006；李健等，2006；王枫等，2007；王严等，2007），其研究结果都表明温度会对外源酶制剂产生影响，经高温处理后外源酶的活性会受到不同程度的损失。Markus Wyss等（1998）报道，烟曲霉和黑曲霉植酸酶在50～70℃时就会发生热变性，pH值2.5的酸性黑曲霉植酸酶在80℃以上高温时会产生不可逆的活性损失作用。尹清强等（2005）研究发现，经60℃调质制粒后与未经调质的粉料相比只有48%～58%的酶活残留，而加热到80℃时仅有2%～15%的酶活存留，随着制粒温度的升高（60～80℃），植酸酶的酶活力将逐渐下降（P＜0.01）。赵春等（2007）研究结果表明，添加有植酸酶并经75℃制粒后饲粮的饲喂效果要比经80、85℃制粒后的饲料饲喂效果好（P＜0.05）。本课题组研究也发现，经高温调质后植酸酶活性显著下降，调质温度为75、85和95℃时饲粮中耐热植酸酶活性下降幅度分别为10.75%、25.65%和30.53%（陈旭，2008）。

生产中为了获得较高的酶活，可选择增加酶添加量及添加耐温物质（脂肪等）以避免因酶高温失活而影响动物生产。此外，还有两种解决植酸酶热变性的常用方法：第一种办法是采用后喷涂技术添加植酸酶，也就是于饲料原料经调质制粒冷却后，将液态的植酸酶制剂均匀喷洒到颗粒饲料表面；后喷涂法避开了高温调质对植酸酶的活性损伤作用，但是它需要有专门的后喷涂设备。另外一种主要的解决办法是提高植酸酶的耐热性能。付石军等（2007）综述了改善植酸酶耐热性的方法，指出可以采用自然选择法、蛋白质工程法、化学修饰法以及包括添加酶稳定剂和制备包被型颗粒在内的生产工艺改善这四种主要方法来提高植酸酶的热稳定性。本课题组把从无花果曲霉中提取的能够耐受高温的植酸酶蛋白基因导入毕赤酵母中，通过毕赤酵母的表达，并采用液态发酵工艺生产而获得耐热植酸酶。试验结果显示，在经75、85、95℃调质后这种耐热植酸酶的活性有明显下降（P＜0.01），但经各温度调质后饲料中耐热植酸酶仍能分别保持89.25%、74.35%、69.47%的相对酶活性（陈旭，2008）。王国坤等（2006）和曲丽君（2007）对泡盛曲霉植酸酶进行了研究；崔富昌（2006）对米曲霉植酸酶进行了研究；陈艳（2004）也对烟曲霉植酸酶进行了研究，他们试验中所选用植酸酶经90℃处理后仅有40%左右残存酶活性。相比之下，本课题组所采用的耐热植酸酶表现出了较好的耐热性能，即使经95℃处理后仍能保持69%以上的酶活性，在普通制粒过程中能保持较高的酶活力，但为达到最佳添加效果则还需考虑其调质时的损失。在较高制粒温度或膨化温度条件下需要考虑适量添加耐温物质以进一步提高其耐热性。

能在现代饲料工业中得到推广并广泛利用的植酸酶必须具有良好的热稳定性。但是，与此同时，我们要注意避免盲目追求耐高温的特性，因为饲料用植酸酶不仅要求能在高温加工之后有较高的活性残留，更为关键的是其在常温下（尤其是在动物机体胃肠道内温度下）也需具有较高的酶活性，否则我们为了耐高温而开发耐高温产品，这就偏离了饲料酶制剂产品设计和开发的主线了。这几年曾经出现市场上盲目追求酶制剂的耐高温性的现象，结果出现有些植酸酶虽然能耐受高温的调质作用，但是在常温下的酶活性却很低，使其在实际应用中受到一定的限制。陈艳等（2004）研究发现，烟曲霉植酸酶的最适反应温度为60℃，65℃时酶活力保持在80%以上，至90℃活力为46.2%，但在37℃活性较低，仅为25.4%。动物胃肠道内的温度一般都在37～41℃，这种烟曲霉植酸酶在37℃时的酶活性只有最适反应温度下的25.4%，因此在实际生产中会对应用效果产生一定的影响。

2 pH值对植酸酶活性的影响

饲料生产中所用的植酸酶主要在动物体胃肠道中发挥作用，在其分解植酸和植酸盐的过程中会受到机体胃肠道内pH值环境的影响，在不同的pH值环境中植酸酶表现出不同的酶活性。王枫等（2007）研究发现，在pH值为4.5～6.0的范围内植酸酶有80%以上的活性，在pH值为5.5处具有最高活性；高于或低于5.5时都会影响植酸酶的活性，在pH值3.5、3.0、2.0处的相对酶活性依次为44.44%、24.05%、3.31%，在pH值6.5、7.0处分别具有49.72%、22.82%的相对酶活，当pH值大于7.5时，仅剩余不足10%的相对酶活性。课题组（2008）对无花果曲霉源植酸酶的酶学特性研究表明，体外条件下，将酶促反应的pH值分别控制在2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0时，该植酸酶在pH值2.0～7.0之间pH值5.5处有一个高峰点，pH值在5.0的相对酶活性与pH值5.5处相接近，为99.25%；pH值由2.0上升至2.5时，相对酶活性迅速由12.25%增至45.72%；在pH值2.5～5.0区间内，相对酶活性随pH值的升高呈较缓的升高；在pH值5.5～7.0区间内，相对酶活性则随pH值的升高而急剧下降，由pH值5.5时的相对酶活100%迅速下降为pH值7.0时的1.85%；pH值为3.5～6.0时，耐热植酸酶的相对酶活性都保持在70%以上，pH值2.5～6.5时相对酶活性都在40%以上，可见此植酸酶可在相对较宽的pH值范围内发挥作用；当pH值＜2.5和pH值＞6.5时，耐热植酸酶的活性都很低，在中性环境中几乎没有活性（陈旭，2008）。而之前我们对芽孢杆菌来源植酸酶的研究时发现，在pH值为4.5时，该植酸酶具有最高酶活，pH值从2.0～3.0，酶活急速升高，从pH值3.0到pH值4.5相对酶学活性逐步上升到最高点；当pH值在4.5～6.0时，相对酶活缓慢降低；当pH值在4.0～6.0之间时，相对酶活保持在80%以上，其中pH值在4.5～5.5之间时，相对酶活都在95%以上（李春文，2007）。

这可能是因为pH值影响酶蛋白的空间结构和催化活性，当环境pH值和植酸酶的最适pH值相差过大时，维持蛋白结构稳定性的次级键遭到破坏，导致其空间结构改变，甚至是活性中心疏水内环境产生变化，致使酶活性减弱或丧失（刘志伟，2007、2008）。另一方面，从植酸酶催化反应机理上讲，环境pH值直接影响植酸酶活性位点氨基酸残基侧链的解离状态（刘志伟等，2008）。而蔡琨等（2004）认为，pH值对酶活性的影响并非是由于酸、碱作用了整个酶分子从而影响整个酶分子的解离状态，而是由于它们改变了酶的活性中心或与之有关的基团的解离状态，从而使酶的活性状态发生改变。

对于不同来源的植酸酶，植酸酶的最适pH值和发挥作用的最适pH值范围也不同。许尧兴等（1999）研究发现，来源于无花果曲霉A.ficuum CN-92的植酸酶最适反应pH值为5.5，适宜范围为5.0～6.6，pH值高于6.0时酶解速度骤降。陈艳等（2004）报道，烟曲霉植酸酶的最适反应pH值为5.0，适宜范围为4.0～5.8，pH值高于7.0，酶解速度骤降至相对酶活不足10%。王国坤等（2006）和曲丽君（2007）研究结果也表明，泡盛曲霉植酸酶最高活性分别在pH值为2.5和5.5时（在pH值2.5时相对酶活力为pH值5.5条件下的90%），在pH值2.0～6.0范围内都有较强的活性（＞60%），因此能很好地适应畜禽动物的消化道环境（唾液腺pH值5.0；胃pH值2.0～4.0；小肠上部pH值4.0～6.0），降解消化系统中的植酸（盐）。王严等（2007）报道，重组植酸酶（黑曲霉WY-6植酸酶）具有很宽的pH值适用范围，在pH值2.5～6.5范围内均能保持较高的酶活力。从这些研究结果可看出，植酸酶发挥作用的最适pH值范围大多在酸性环境中有比较宽的pH值范围内。本课题组试验所用耐热植酸酶在不同pH值环境中表现出不同的酶活性。

也有许多学者对其是否适合在机体胃肠道内发挥作用及发挥作用的主要部位进行了研究。史凯来等（2000）报道，在鸡嗉囊pH值（pH值5.0～6.0）环境下，植酸酶的相对标准酶活为100%，可以充分发挥作用。Taewan等（2006）通过改变黑曲霉植酸酶PhyA上的pH值相关位点获得了突变体E228K，试验证明，该突变体表达所得的植酸酶能适应胃中pH值，在机体胃中发挥作用，提高了其作为动物饲料添加剂的有效性。刘志伟（2007）研究发现，黑曲霉植酸酶在pH值2.5～7.5（肉仔鸡消化道）酶活性可保持在30%以上，其中在pH值4.5（嗉囊）的条件下活性最高，其次是pH值2.5、pH值3.0及pH值3.5（胃部），在pH值6.0和pH值7.0（小肠）最低，据此判定植酸酶在肉仔鸡的消化道内的适宜作用位点为嗉囊、十二指肠和空肠前段。程万莲等（2007）研究结果与上述报道有所不同，其研究结果表明，42日龄和70日龄海兰褐蛋鸡肌胃的pH值在2.5～3.4，超过了植酸酶的活性范围，因此在肌胃中没能检测到植酸酶活性，而小肠食糜的pH值为6.0～7.0，能够检测到植酸酶活性。从上述研究结果可以看出，一般在pH值4.5～5.5左右植酸酶具有最高的酶活性。

此外，近年来，为了最大程度利用植酸酶在动物体内发挥酶解作用，开发具有较宽的适宜作用pH值范围的植酸酶是一个重要的发展方向。其中，最主要的手段是通过基因工程技术、修饰改良等技术开发在不同pH值条件下具有两个或者多个活性高峰的植酸酶。李健等（2006）选择的植酸酶适宜pH值范围内却有两个酶活高峰点，即一个在pH值2.5处，一个在pH值5.5处。本课题组试验所用耐热植酸酶适宜作用pH值范围内只有一个高峰点，最适作用pH值为5.5，随着pH值由2.0上升至5.5，耐热植酸酶的酶活性逐渐上升，当pH值高于5.5后植酸酶的活性迅速下降（陈旭，2007），这与王强（2006）研究的植酸酶特点相一致。

从pH值对植酸酶的酶活影响程度考虑，忽略其它因素对植酸酶活性的影响，可以看出大部分植酸酶能适应畜禽胃肠道中pH值，可以较大程度地发挥水解植酸的作用。

3 矿物元素对植酸酶活性的影响

植酸酶添加到饲料中，进入机体胃肠道后，动物机体本身和饲料的各种离子都将对其活性产生影响。很多学者对不同来源的植酸酶进行了研究（许尧兴等，1999；马合勤，2002；郑涛，2005；潘力等，2006；陈旭等，2008），他们的研究结果均表明，不同浓度、不同种类的金属离子会对植酸酶活性产生不同程度的影响。

许尧兴等（1999）研究表明，Fe2+对植酸酶有抑制作用，而郑涛（2005）研究发现，Fe2+对植酸酶有激活作用。Fe2+除在低浓度（5 μmol/l）时有酶活抑制作用外，在其它浓度中都表现出明显的酶活促进作用（陈旭，2008）。另外，本课题组试验结果与许尧兴等（1999）、王国坤等（2006）和曲丽君（2007）结果基本一致，不同的是本课题组试验发现，中高浓度（10、20、40 μmol/l）Fe2+对植酸酶活性有促进作用。虽然两试验所采用的植酸酶均来自于无花果曲霉属，但所用Fe2+浓度不同，因此，该试验结果的差异可能是由于植酸酶结构的差异或金属离子浓度的不同所引起的。

Liu等（2005）和张政军等（2006）对碱式氯化铜（TBCC）和硫酸铜对植酸酶存留率的影响进行了研究，试验结果表明，在提高植酸酶储存稳定性方面，添加TBCC比添加硫酸铜具有更好的效果。但我们的研究发现，虽然低浓度Cu2+对酶活的抑制作用不明显（P＞0.05），但高浓度（40 μmol/l）时效果显著（0.01＜P＜0.05）（陈旭，2008）。在我们的试验中，中高浓度（10、20、40 μmol/l）Zn2+对耐热植酸酶酶活均有显著的抑制作用（陈旭，2008）。这可能是由于Zn2+和Cu2+与酶促反应的植酸钠形成了复合物，降低了底物的有效浓度，从而使植酸酶活性受抑制。何为等（2004）也认为，金属离子对酶活性的抑制作用可能是因为这些金属离子如Cu2+可能影响了酶分子中巯基的还原状态，使之氧化，从而改变酶的构象，使酶失活。

本课题组研究还发现，Ca2+、Mn2+和高浓度（40 μmol/l）的Mg2+有显著的酶活促进作用（陈旭，2008）；这可能是因为Ca2+、Mg2+、Mn2+是该耐热植酸酶的活性辅助因子，影响酶与底物的结合及解离状态，达到一定浓度时有酶活促进作用（何为等，2004）。此外，Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+6种离子的混合体有显著抑制植酸酶活性的作用。

本课题组上述试验结果与陈艳等（2004）和王严（2007）研究结果基本相同。但与王国坤等（2006）和曲丽君（2007）的报道结果相反，他们的研究结果表明，Ca2+、Mg2+、Mn2+对植酸酶活性有轻微的抑制作用，Fe2+、Zn2+对酶促反应有显著的抑制作用。出现这种差异的原因之一是由于所添加金属离子浓度不同，本课题组试验所用Ca2+浓度为0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/l，金属离子Mg2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+都各为5、10、20、40 μmol/l，而王国坤等（2006）和曲丽君（2007）试验中所用各离子的浓度均为1 mmol/l；另外一个原因是由于植酸酶来源不同，本课题组试验所用植酸酶为从无花果曲霉中提取的耐高温植酸酶基因于毕赤酵母中表达而得，而王国坤等（2006）和曲丽君（2007）试验所用均为源于泡盛曲霉的植酸酶。

从应用学的角度来看，动物饲料和消化代谢过程中矿物元素都是不可或缺的，这是酶制剂应用中潜在的问题。在实际生产中，应选择矿物元素抑制作用小的植酸酶制剂，同时减少不必要矿物元素的添加，尤其是对植酸酶制剂酶活有抑制作用的矿物元素。

4 植酸酶对胃肠道消化酶的耐受性

外源酶制剂一般由微生物发酵而得，其本质是具有催化活性的蛋白质，因此当外源酶制剂进入畜禽消化道后，其作为蛋白质需要经受机体胃肠道内内源性蛋白酶（如胃蛋白酶和胰蛋白酶等）的作用。所添加的外源酶制剂在动物机体内是否能耐受动物机体内源消化酶的消化分解，能否保持自身的酶活性，这是外源酶制剂在实际应用过程中必须解决的问题。沈水宝（2002）研究发现，α-淀粉酶不能耐受胃蛋白酶的作用，酸性蛋白酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶对胃蛋白酶的耐受性较好。于旭华（2004）研究发现，分别来自细菌和真菌的两种木聚糖酶经胃蛋白酶处理后相对酶活性迅速下降，酶活损失达70%以上，但是这两种木聚糖酶对胰蛋白酶的耐受性较好，经胰蛋白酶处理后酶活性存留都在80%以上。

近年来，关于植酸酶对胃肠道消化酶耐受性的研究报道逐渐增多，但多数集中于对胃蛋白酶的耐受性研究。研究结果显示，植酸酶对胃蛋白酶有不同程度的耐受性，胰蛋白酶对植酸酶的酶活抑制作用比胃蛋白酶大。王银东等（2006）试验结果表明，植酸酶经不同浓度胃蛋白酶作用后均能保持酶活性不变，表现出对胃蛋白酶极好的耐受性。王严等（2007）对重组黑曲霉WY-6植酸酶的研究也发现，植酸酶对胃蛋白酶的抗性较高，加入高浓度胃蛋白酶后仍能保持70.9%的相对酶活性。张铁鹰等（2006）研究发现，植酸酶活性在pH值3.0环境中较为稳定，相对酶活性保持在85%以上，当肉仔鸡按照5.86 mg/ml水平添加胃蛋白酶，植酸酶的相对酶活性下降至65%；植酸酶在pH值6.0环境中相对酶活性保持在60%～70%，当肉仔鸡按照8.4 mg/ml水平添加胰蛋白酶，植酸酶的相对酶活性急剧降至30%左右。该试验结果表明，植酸酶不能耐受胃蛋白酶和胰蛋白酶，胰蛋白酶对植酸酶活性的抑制作用要比胃蛋白酶强。本课题组试验研究也发现，经不同浓度的胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，耐热植酸酶的相对酶活性均显著降低（P＜0.01），经不同浓度胃蛋白酶处理后，无花果曲霉源植酸酶的相对酶活性几乎没有变化，维持在83%左右，但随着胰蛋白酶添加量的加大，耐热植酸酶的相对酶活逐级递减（P＜0.01），由2.5 U/ml胰蛋白酶处理后的75.44%相对酶活性降低至20 U/ml时的60.79%，胰蛋白酶对耐热植酸酶的活性抑制作用强于胃蛋白酶（陈旭，2008）。

理论上，胃蛋白酶可以切割黑曲霉植酸酶肽段上127个位点，胰蛋白酶对黑曲霉植酸酶肽段有33个切割位点，虽然胃蛋白酶的酶切位点远多于胰蛋白酶，但是胰蛋白酶对植酸酶的破坏作用要强于胃蛋白酶，可能是因为植酸酶在pH值6.0下的蛋白结构同pH值3.0下相比更有利于蛋白酶的切割（刘志伟，2007）。

5 结语

不同结构植酸酶制剂的酶学特异性和抗逆性存在差异，应注意温度、pH值、矿物元素和胃肠道消化酶对植酸酶活性的影响。在选用植酸酶制剂时，应根据实际生产和动物生理特点从上述四个方面评价植酸酶，以选择酶活较高、稳定性较好的植酸酶产品。

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