热休克蛋白70的生物学功能及其诱导剂——谷氨酰胺在畜牧业中的应用

孙培明

热休克蛋白（heat shock protein，HSP）或热应激蛋白（heat stress protein，HSP）是机体受到应激原的刺激后产生的几族高度保守的蛋白质，对维持细胞生存和内环境的稳定起重要作用。其中热休克蛋白70(HSP70)是最重要的一种HSP，它具有多种生物学功能，包括分子伴侣功能、参与免疫反应、抗细胞凋亡功能、抗氧化功能、提高细胞的应激耐受性、促进细胞增殖、参与细胞骨架的形成和修复等等，其广泛的生物学功能使之成为当今生命科学研究中的热点[1]。高热是HSP的一种常见诱导方式，但是会引起机体的病理损伤，此外，一些化学性药物也可以诱导HSP的表达，如重金属、谷氨酰胺、中草药和水杨酸钠等[2-3]。谷氨酰胺(glutamine，Gln)具有副作用小、安全有效、价格便宜的特点，被认为是一种极有潜力的HSP诱导剂。Gln具有多种生物学作用，是一种条件性必需氨基酸，是体内最丰富的氨基酸之一，能特异性地增强HSP70的表达，在畜牧业上可为开发新型、高效、安全的抗应激饲料添加剂提供新思路。本文对HSP70的生物学功能、Gln对HSP70的诱导作用及机理、Gln在畜牧业中的应用、Gln的应用前景及注意事项等进行了综述，为Gln在畜牧业中的应用提供参考。

1 热休克蛋白70的生物学功能

1.1 分子伴侣功能

分子伴侣是指能够结合和稳定其它蛋白质的不稳定构象，并能促进新生多肽的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输的一类蛋白质。分子伴侣是HSP70最基本的生物学功能，它广泛分布于细胞核、细胞质、内质网、线粒体等细胞器中，参与所有细胞内蛋白质的合成和定位、蛋白质的成熟、错误折叠蛋白质的降解及调节过程。HSP70作为一种重要的分子伴侣，可以参与识别和稳定胞浆内蛋白折叠装配成天然状态前的伸展多肽链；帮助分泌性蛋白与线粒体蛋白分别进入内质网管腔或线粒体基质，并在其进入这些细胞器后折叠成天然构象前稳定其伸展状态；参与蛋白寡聚体的重排与蛋白质凝聚物的解体和快速转换的胞浆蛋白进入溶酶体内的降解；参与细胞质的内吞作用；此外，类固醇激素受体复合物中存在HSP70，可能与该复合物的装配有关[4]。

1.2 参与免疫反应

HSP70参与免疫反应是最先在肿瘤研究中发现的，肿瘤免疫也是当前HSP70主要研究方向。1986年，Srivastava等[5]在小鼠肿瘤移植实验中获得一系列排斥肿瘤的抗原，发现这些抗原属于HSP，分别是HSP90、HSP70和HSP60，但从正常组织中提取的HSP不具有免疫活性；后来证实，所获得的抗原并非单一的HSP，而是HSP和多肽的复合物。HSP70在免疫反应中的主要作用是直接或间接加工提呈抗原，这也是HSP70能够提高免疫效率的关键所在。抗原加工提呈受主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制，由此可分为MHCⅠ类途径和MHCⅡ类途径。HSP70不仅参与MHCⅠ类途径和MHCⅡ类途径，而且还具有类似MHCⅠ类分子结合抗原肽的结构域，另外还可以作为抗原提呈分子直接将抗原肽提呈至细胞表面激发特异的γδT细胞反应[6]。巨噬细胞（Mφ）在HSP70参与抗原提呈MHCⅠ类途径中起着重要作用。Mφ中有HSP70的受体，HSP70多肽复合物与Mφ结合并被摄取，通过Mφ上的MHCⅠ类分子递呈，最终激活以CD8+T细胞为主的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）；同时HSP70多肽复合物还能诱导Mφ分泌IL-1、IL-2、TNF-α和IFN等细胞因子。

1.3 抗细胞凋亡作用

细胞凋亡（apoptosis）或程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）是受基因调控的一种主动性细胞自杀过程。它不仅是一种重要的生理现象，也是一种重要的病理现象，是与许多疾病紧密相联的。研究表明，HSP70的表达对各种因素诱导的细胞凋亡有抑制作用[7]。HSP70抗细胞凋亡作用机制可能主要与HSP70抑制应激活化蛋白激酶（stress activated protein kinases，SAPK；c-junN-terminal kinases，JNK）活性有关，同时与抑制半胱氨酸蛋白酶（caspase）活性和抑制促凋亡基因的表达也有密切关系。谭红梅等[8]在HSP70调节JNK活性与细胞凋亡的研究中发现，细胞凋亡对JNK的依赖性与HSP70的抗细胞凋亡作用有明显的相关性，细胞内HSP70的表达可以通过阻断信号通路，抑制应激诱导的JNK激活，从而抑制细胞凋亡。Mosser等[9]在研究HSP70对应激诱导细胞凋亡的作用时发现，表达的HSP70能抑制caspases-3的活性，认为这可能是HSP70抗细胞凋亡作用的主要机制。Gordon等[10]发现，上调HSP70表达能抑制P53和P53介导的细胞凋亡，并抑制另一种促细胞凋亡基因——Bax的表达。

1.4 抗氧化作用

HSP70通过减少应激时氧自由基的产生而提高应激细胞的抗氧化作用，一方面可以通过抑制产生氧自由基的关键酶（NADPH氧化酶），减少氧自由基的产生；另一方面可以通过直接释放和增加内源性过氧化酶，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），而经过化学反应除去氧自由基。Das等[11]发现，缺血再灌注引起了数种应激相关的抗氧化基因的激活，包括HSP70 Mn-SOD基因。Niedzwiecki等[12]在37℃果蝇中发现，SOD-mRNA水平的增高与HSP70 mRNA表达的增高相一致。

1.5 抗应激作用

应激作用后，机体中HSP70的分布和表达发生显著变化，这是HSP70发挥抗应激作用的重要体现。Angelidis等[13]发现，细胞内HSP70数量增加，细胞抗热性亦增加；细胞内HSP70数量减少，细胞抗热性降低。王枫等[14]在HSP70高表达对K562细胞热耐力的影响研究中发现，HSP70水平高的细胞其热耐力明显高于HSP70水平低的细胞，HSP70水平与细胞的热耐力呈正相关。HSP70可以稳定应激时胞浆内蛋白质的结构和预防胞浆内蛋白质发生聚集，还可以迁徙到核仁中，与部分组装的核糖体建立联系，从而保护细胞核蛋白；应激细胞内HSP70水平的增高可以阻断细胞凋亡的信号通路，抑制应激活化蛋白激酶的活化，从而抵抗细胞凋亡；HSP70在细胞内具有抗氧化的生物学活性，可以保护应激细胞抵抗过氧化物的损害；HSP70具有免疫调节作用，有人称其为“伴侣因子”，它在抗应激免疫损伤方面发挥着一定作用；在应激过程中，HSP70还参与细胞骨架的形成与修复。

1.6 其它生物学功能

除了以上生物学功能之外，HSP70还具有促进细胞增殖，参与细胞骨架的形成和修复等功能[4]。

2 谷氨酰胺对热休克蛋白70的诱导作用及机理

2.1 谷氨酰胺对热休克蛋白70的诱导作用

大量的研究结果表明，Gln能诱导动物产生HSP，且能特异性地增强起主要保护作用的HSP70的表达。Sanders等[15]在研究Gln对果蝇Kc细胞的HSP表达的体外影响时发现，向热处理的Kc细胞培养液里加入Gln，其添加量越高HSP表达水平越高，他认为Gln对HSP的表达起重要作用。Wischmeyer等[16]以鼠作为实验动物模型，通过静脉灌注方式供给Gln，结果发现当Gln灌注剂量为0.15～0.75 g/kg时，在鼠体内的多处器官，如心、肺、结肠等，HSP70的表达增加。吴琼等[17]在Gln对大鼠HSP70表达的影响的研究中发现，静脉注射可在大鼠心、肝、肺和主动脉中诱导HSP70 mRNA的表达，且存在剂量依赖性关系，其起始剂量0.15 g/kg即可引起各脏器的HSP70表达。0.75 g/kg Gln注射后1 h、6 h和12 h均获得了HSP70的表达，并明显高于24 h和48 h，说明Gln注射后1～12 h是诱导HSP70 mRNA表达的高峰期，期望这能为临床用药时机提供参考。张志宏等[18]在谷氨酰胺对小白鼠HSP70诱导表达的研究中发现，尾静脉注射Gln，4 h后检测mRNA和蛋白水平，小鼠肝脏、子宫和卵巢组织细胞的HSP70均已诱导表达，且HSP70表达量随着Gln剂量的加大而增加；0.45 g/kg时HSP70表达量显著提高。

2.2 谷氨酰胺对热休克蛋白70的诱导机理

HSP70的表达调控表现在转录和翻译两个水平，且主要是在转录水平，转录水平的调控与热休克因子和热休克元件相关。无应激状态下，热休克因子以无活性的单体形式存在；当细胞处于应激状态时，热休克因子由单体向三聚体转换，每3个热休克因子单体结合在一起形成一个三聚体。在多种热休克蛋白基因的启动子区内都有1个或数个高度保守的DNA序列，其作用是与热休克因子进行特异性结合，激活热休克蛋白基因的转录活化，这种高度保守的DNA序列称之为热休克元件。在应激条件下，热休克因子三聚体与热休克元件结合，加快了RNA聚合酶从暂停点上的逸脱速度(100倍以上)，使其具有了连续转录延伸的活性，从而上调基因表达的水平[19]。许多研究表明，Gln对HSP70的诱导主要通过改变热休克因子的活性而发挥作用。Peng等[20]通过基因敲除的方法研究Gln对小鼠成纤维细胞的影响，结果发现，热休克因子被敲除的细胞在添加Gln后，不能减轻热应激对细胞的损伤。Angela等[21]通过试验也证明Gln增强细胞对应激损伤的抵抗力是通过热休克因子起作用的。

3 谷氨酰胺在畜牧业中的应用

3.1 谷氨酰胺作为抗应激添加剂

近年来大量研究发现，当动物处于应激状态时，添加Gln有助于增强机体对应激的抵抗力，Gln被认为是一种极有发展前景的动物抗应激添加剂。

3.1.1 增强机体抗氧化能力

应激可导致大量自由基的产生和释放，引发脂质过氧化作用，还可以限制谷胱甘肽的合成，引起机体抗氧化能力下降，导致多个器官功能的损害。Gln是细胞合成谷胱甘肽的前体物质，可通过保持和增加组织细胞内谷胱甘肽的储备，有利于保护或减轻内皮细胞免受氧自由基介导的损伤，稳定细胞膜和蛋白质结构，也有利于受损细胞的修复和功能恢复，提高机体抗氧化能力[22]。

3.1.2 提高机体免疫力

机体发生应激时，免疫器官及其功能会受到损伤。Gln具有免疫调节作用，它是淋巴细胞分泌、增殖及其功能维持所必需的。作为核酸生物合成的前体和主要能源，Gln可促使淋巴细胞、巨噬细胞的有丝分裂和分化增殖，增加细胞肿瘤坏死因子、白细胞介素1等的产生[23]。此外，Gln具有维持肠道免疫功能的作用，促进肠道黏膜产生更多分泌型免疫球蛋白，阻止细菌和内毒素的移位，增加机体的免疫能力。

3.1.3 补充机体需要的营养和能量

机体处于应激状态时对于营养物质的需求增加，需要产生更多的能量供给机体。Gln具有重要的营养作用，是合成嘌呤、嘧啶、氨基酸、蛋白质、核酸、谷胱甘肽和许多其它生物分子的前体物质，是机体内各器官之间转运氨基酸和氮的主要载体，也是快速生长和分化细胞的主要燃料[24]。另外，Gln还是肠道的主要能量来源，谷氨酰胺大约有2/3的碳被氧化成二氧化碳，约占肠道总量的40%。Gln也是一种大脑燃料，它是少数几种能克服血脑屏障和参与化学反应的物质之一，在大脑中被转化为谷氨酸与葡萄糖一起参与脑代谢。

3.1.4 调节机体酸碱平衡

在应激状态下，动物机体需要更多的能量，无氧酵解增加，产生过多的乳酸，在不同程度上引起代谢性酸中毒。Gln是肾产氨最重要的前体，对机体内酸碱平衡的调节起着十分重要的作用[24]。Gln抗酸作用的机理是：谷氨酰胺从肌肉、肝、肺等器官释放出来被肾远端小管还原成氨和谷氨酸，氨结合氢离子成氨离子，与阴离子如氯离子一起排出体外。

3.1.5 诱导热休克蛋白70表达间接发挥作用

作为一种非特异性的细胞保护蛋白，HSP70在应激条件下参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程，保护细胞生命活动。Gln通过对HSP70的诱导表达，使其在稳定细胞的蛋白质结构、抗应激细胞凋亡、抵抗过氧化物的损害和抗应激免疫损伤等方面发挥着重要作用。虽然HSP70对细胞具有保护作用，但是这种保护作用不是无限的，而是只能在一定范围内起作用，如应激时间过长，会导致细胞的死亡。

3.2 谷氨酰胺作为营养添加剂

Gln作为体内最丰富的氨基酸之一，具有重要的营养功能，在改善机体代谢、促进蛋白质合成、改善机体免疫状况、能量供给和增长肌肉等方面发挥着重要作用，因此有人称之为“免疫营养素”。

董金格等[25]在外源添加Gln对肉仔鸡生长性能和胴体组成的影响研究中发现，外源添加Gln具有提高肉仔鸡日增重和降低料重比、提高胸肌率和腿肌率、降低脂肪含量以及改善肉仔鸡胴体组成的趋势，其中0.5%的添加量效果最佳。黄冠庆等[26]在研究中发现，在肉仔鸡饲料中添加适宜的Gln，有利于提高肉仔鸡的体重、日增重、饲料报酬和成活率，添加量为0.8%时效果最好，且Gln添加量为0.8%时可明显提高21日龄时法氏囊、脾脏、肝脏和胰腺的重量以及法氏囊指数。李红等[27]报道，在断奶仔犬日粮中添加2%Gln后，其平均日采食量比对照组提高18.8%，平均日增重提高48.9%，说明Gln能明显地改善断奶仔犬的生长性能。

4 谷氨酰胺应用前景及注意事项

4.1 谷氨酰胺应用前景

在现代畜牧业生产中，畜禽正面临越来越多的应激，结果导致其采食量下降、生长速度缓慢，甚至引起死亡，给畜牧业带来了重大的经济损失。为了减缓应激带来的不良后果，除了通过物理措施改善动物的外界生长环境外，还可通过添加抗应激添加剂，如维生素制剂和微量元素，但是单一作用的抗热应激添加剂的作用是有限的，具有复合作用的单一添加剂或几种添加剂组成的复合添加剂的使用效果更好。HSP70具有广泛的生物学功能和细胞保护作用，利用HSP70诱导剂作为抗应激的添加剂在临床上具有重要意义。Gln被认为是一种极有潜力的热休克蛋白诱导剂，它可以显著地提高动物机体HSP70的表达，还可以促进蛋白质合成、刺激细胞生长、激活免疫和调节酸碱平衡等。Gln作为饲料添加剂使用时，是一种极有发展前景的新型抗应激药物和动物营养性饲料添加剂，在临床上具有极大的推广价值。

4.2 注意事项

Gln制剂已经广泛应用于医学临床，主要是通过口服和静脉注射来用药的。但应注意以下事项：Gln为氨基酸类药物，若服用剂量过大或长期服用会对肾脏造成一定的损害；Gln能增加肠道对钠和水的吸收，长期服用有可能造成便秘；对有严重的肝功能损伤的病人禁用Gln，因血氨增加可诱发肝性脑病甚至肝昏迷；Gln在高温下不稳定，会被分解破坏，忌与加热的食物混合摄入；Gln对酸敏感，忌与含酸量高的食物或酸性的药物混合使用。畜牧业中，作为营养添加剂使用时，可以添加到饲料中，一般剂量为0.5%～1%；作为抗应激添加剂使用时，可以添加到饮水中，但应注意Gln水中溶解度和稳定性，宜现配现用。除了Gln之外，新的Gln供体已经出现，如人工合成的谷氨酰胺双肽，包括甘氨酸-谷氨酰胺和丙氨酸-谷氨酰胺。它们具有稳定性好、水溶性强、能耐受热等优点，在体内迅速水解转化为Gln，具有Gln应用的全部理化特性，在临床上具有更广阔的应用前景。

[1] Linquist S，Craig E A.The heat shock proteins[J].Annu.Rev.Genet.,1998，22：631-633.

[2] Wischmeyer P E.Glutamine and heat shock protein expression[J].Nutrition，2002，18(3)：225-228.

[3] Cheng Y，Liu Y F,Liang J.Zinc is a potent heat shock protein inducer during liver cold preservation in rats[J].Chinese Medical Journal，2002，115(12)：1777-1779.

[4] Juliann G K，George C T.Heat shock protein 70 kDa：molecular biology，biochemistry and physiology[J].Pharmacol Ther.,1998，80(2)：184-185.

[5] Srivastava P K，DeLeo A B,Old L J.Tumor rejection antigens of chemically induced sarcomas of inbred mice[J].Proc.Natl.Sci.USA，1986，83：3407-3411.

[6] 郭建巍，蔡美英.HSP70抗原呈递分子的研究进展[J].微生物学免疫学进展，2000，28(3)：95-98.

[7] Kim Y M，Watkins S C，Billiar T R，et al.Nitric oxide protects cultured rat hepatocytes from tumor nexrosis factor-alpha-induced apoptosis by inducing heat shock protein 70 expression[J].J.Biol.Chem.,1997，272(2)：1402-1411.

[8] 谭红梅，吴伟康.HSP70调节应激活化蛋白激酶JNK活性与细胞凋亡[J].中国病理生理杂志，2001，17(5)：477-478.

[9] Mosser D D，Caron A W，Bourget L，et al.The chaperone function of HSP70 is required for protection against stress-induced apoptosis[J].Mol.Cell Biol.,1997，17(9)：5317-5327.

[10] Gordon S A，Hoffman R A，Simmons R，et al.GSHRS Induction of heat shock protein 70 protects thymocytes against radiation-induced apoptosis[J].Arch.Surg.,1997，132(12)：1277-1282.

[11] Das D K，Engelman R M,Kimura Y.Molecular adaptation of cellular defences following preconditioning of the heart by repeated ischemia[J].Cardiovasc Res.,1993，27(4)：578-584.

[12] Niedzwiecki A，Reveillaud I，Fleming J E.Changes in superoxide dismutase and catalase in aging heat-shocked Drosophila[J].Free Radic Res.,Commun.，1992，17(6)：355-367.

[13] Angelidis C E，Lazaridis I,Pagoulatos G N.Constitutive expression of heat-shock protein 70 in mammalian cell confers thermoresistance[J].European Journal of Biochemistry，1991，99：35-39.

[14] 王枫，赵法伋，郭俊生.HSP70高表达对K562细胞热耐力的影响[J].中国公共卫生，2000，16(7)：587-588.

[15] Sanders M M，Kon C.Glutamine is a powerful effector of heat shock protein expression in Drosophila Kc cells[J].Cell Physiol.,1991，146(1)：180-190.

[16] Wischmeyer P E，Kahana M D,Wolfson R.Glutamine induces heat shock protein and protects against endotoxin shock in the rat[J].Journal of Applied Physiology，2001，90(5)：2403-2410.

[17] 吴琼，景亮.谷氨酰胺诱导大鼠热休克蛋白70 mRNA的表达[J].国际麻醉学与复苏杂志，2006，27(2)：69-71.

[18] 张志宏，田文儒，李辉辉，等.谷氨酰胺诱导小鼠热休克蛋白70表达的研究[J].中国农业科学，2009，42(4)：1428-1434.

[19] Wu C.Heat shock transcript ion factors:structure and regulation[J].Annu.Rev.Cell Dev.Bio.,1995，11：441-469.

[20] Peng Z Y，Serkova N J，Kominsky D J.Glutamine-mediated attenuation of cellular metabolic dysfunction and cell death after injury is dependent on heat shock factor-1 expression[J].Journal of Parenteral and Enteral Nutrition，2006，30(5)：373-379.

[21] Angela L M，Martin D，Kristen D S.Glutamine’s protection against cellular injury is dependent on heat shock factor-1[J].Cell Physiology，2006，290(6)：1625-1631.

[22] 董金格，万晓媛，邹晓庭，等.外源添加谷氨酰胺对肉仔鸡生长性能及抗氧化指标的影响[J].饲料工业，2008，29(22)：4-6.

[23] Yaqoob P，Calder P C.Cytokine production by human peripheral blood mononuclear cells:differential sensitivity to glutamine availability[J].Cytokine，1998，10(10)：790-794.

[24] Melis G C，terWenqel N，Boelens P G，et al.Glutamine recent developments in research on the clinical significance of glutamine[J].Curr.Opin.Clin.Nutr.Metab.Care,2004，7(1)：59-70.

[25] 董金格，胡家澄，邹晓庭，等.外源添加谷氨酰胺对肉仔鸡生长性能和胴体组成的影响[J].中国饲料，2009(1)：33-35.

[26] 黄冠庆.外源谷氨酰胺对肉仔鸡免疫器官发育的影响[J].饲料工业，2003，24(7)：29-30.

[27] 李红，赵武，刘伟，等.谷氨酰胺对幼犬生长发育的影响[J].中国工作犬业，2005(11)：14-15.