癫痫发作诱导神经元死亡的机制

陈玉华

(黄石理工学院医学院,湖北黄石 435003)

0 引言

癫痫是一种普遍的以慢性神经障碍为主要特征的反复发作的疾病。实验证实癫痫发作能杀死神经元,主要是通过谷氨酸和它的同类物的神经毒作用而导致细胞死亡[1]。除此之外,发作也激活凋亡途径。凋亡信号通路是胞内细胞器功能干扰后启动的(内源性途径)或通过激活细胞表面死亡受体(外源性途径)启动的,由Bcl-2和caspase基因家族结合起来的信号级联通路。在本文中,提供了从实验发作动物模型和难治的颞叶癫痫病人临床资料获得的这些通路的证据。发作引起线粒体功能障碍并激活的内源性途径组分包括凋亡前Bal-2家族蛋白和caspases,这个过程也许由钙离子部分诱导。外源性途径,即死亡受体途径,也是快速地参与到实验发作和病人大脑中,是不依赖钙离子的途径。研究表明一氧化氮(nitric oxide,NO)可诱导癫痫发作后细胞凋亡的发生[2],然而 NO诱导癫痫发作后细胞凋亡机制仍不清楚。核因子-κβ(nuclear factorκβ,NF-κβ)作为一种重要的信号传导因子,可通过其 p65/p 50异源二聚体的活化形式进入细胞核与 DNA上相应靶基因位点结合对细胞内外界刺激作出快速反应。本文就癫痫发作诱导神经元死亡的机制进行综述,为癫痫发作的大脑保护和辅助治疗提供理论依据。

1 癫痫持续状态诱导未成熟大脑神经元死亡

大量研究表明,实验中的SE(status epilepsy,SE)诱导正在发育的大脑神经元死亡[3]。在2周龄的SE模型小鼠中,海马 CA 1椎体细胞层神经元有广泛损伤,而在齿状回的内部颗粒细胞层有适度的神经元损伤。光镜和电镜结果表明这 2种细胞群以不同的模式死亡[4]。通过苏木精和伊红(HE)染色,癫痫持续状态(SE)后24～72 h,CA 1损伤的神经元以嗜酸性的胞质溶胶和浓缩的细胞核为主要特征,这些特点是坏死的特征。而在相同动物的齿状回,在SE后 7～72 h,嗜酸性的细胞出现胞核片断化。通过电镜的半定量分析表明 SE后6～72 h在 CA 1坏死是普遍的死亡形式[4]。在SE后 6 h显示出早期的内质网和线粒体肿胀,在24 h显示出肉眼可见的细胞质和细胞器肿胀、质膜的丧失和斑块状核等明显的坏死形态。而齿状回损伤的神经元表现出凋亡的形态,如出现大而圆的染色质凝块、核膜的丧失以及质膜的维持。

Fujikawa等研究发现,发作诱导的神经元死亡在很大程度上来自谷氨酸能神经递质门控的过度Na+和 Ca2+进入神经细胞和细胞肿胀破裂、自由基产生,产生的自由基损伤 DNA和激活蛋白酶,导致细胞和细胞器质膜的蛋白水解,最后细胞坏死[1]。谷氨酸盐受体拮抗物保护神经元免受发作损伤,但是由于其神经毒的副作用,不能实现其治疗价值,特别是对未成熟个体,这些药物会影响其大脑的正常功能。因此,为增强药物作用的特异性有必要寻找对发作诱导神经元死亡可供选择的靶标。

2 发作后的细胞死亡机制

2.1 发作激活内源性途径

推测内源性凋亡途径可能是由发作激活,因为体外实验揭示暴露在高浓度钙离子下的大脑神经元线粒体释放细胞色素 C。使用引起短期持续的局灶癫痫小鼠模型证实癫痫发作后 2 h内损伤的海马神经元释放细胞色素C,且与Apaf-1,及与之同量激活的caspases 9和caspases 3的出现以及随后的DNA片段化相关。此后许多实验室也相继报道了发作后有caspase的激活[5]。

当单独提高细胞内的钙离子也许足以激活内源性途径。上游前凋亡BH3结构域(Bcl -2同源结构域3),只有成员BAD(Bcl-2相关死亡蛋白),Bid和Bim(Bcl-2相互作用细胞死亡调节子)能通过钙离子依赖的机制被激活,并且发现在体内都可以通过发作激活[6]。

研究证实内源性凋亡途径可以依赖药物介入明显激活,但是其特异性是有限的。有靶向作用的caspases或前凋亡Bcl-2蛋白虽然不是完全地但可以减少发作诱导的神经元死亡。在小鼠中提供了更多的选择途径用以解决这些问题,并且新近研究的小鼠模型证实,敲除某种前凋亡或抗凋亡 Bcl-2家族基因会明显减轻发作后的海马损伤[7]。

另外,以难治的颞叶癫痫病人手术获得的颞叶为研究材料,实验发现颞叶癫痫病人的颞叶新皮质表达高水平的Bcl-2,Bcl-X和激活的caspase 3。最新关于颞叶癫痫海马的研究证实caspase 3激活并且证明前凋亡Bim基因的调节改变[6]。在海马神经元细胞核内有caspase激活的DNase(但没有AIF参与)的积累暗示caspases的下游底物也参与这个过程[8]。然而,仍不清楚病人大脑中到底哪条途径到达细胞死亡的终点,因为在这个样本中显示出末端 DNA片段化的细胞很少,表明同时进行着抗凋亡过程[6]。

2.2 发作激活外源性途径

外源性途径即死亡受体激活,如肿瘤坏死因子受体(tumour necrosis factor receptor 1,TNFR1)与TNF-α、Fas与FasL的结合等是外源性凋亡调控途径的起始环节。这些激活的死亡受体通过其细胞内的死亡区域(death domain,DD)来分别募集Fas相关死亡结构域(Fas-associated death domain,FADD)或TRADD(TNFR-associated death domain)。FADD通过其N末端死亡效应区(death effector domain,DED)的寡聚化并激活caspase-8酶原,形成细胞凋亡信号转导复合物(death-inducing signalling complex,DISC),并负责向下转导凋亡调控信号。TRADD一方面通过与FADD结合而诱导caspase-8酶原活化;另一方面则通过募集TRAF1、2(TNFR-associated factor1、2)及RIP(receptor interacting protein)等因子,通过一系列的信号转导,最终可以抑制caspase-8的表达。caspase-8的抑制则表现出对神经细胞的保护作用[9],同时减少一些下游事件的发生,如线粒体途径caspase-9的裂解和细胞色素 C的释放。研究也证实在癫痫发作早期TNFR 1和Fas表达上调及其配基TNF-α和FasL均为释放增加,并且发现在发作损伤的鼠海马中出现 DISC,该复合物包含细胞内分子效应器,如FADD和caspase-8[10]。在颞叶癫痫(temporal lobe eplipesy, TLE)病人的海马中也检测到相似的结果[11]。这些结果有力地证实了外源性凋亡调控途径参与了 SE后神经细胞的损伤过程。

2.3 SE在海马CA 1区和齿状回不同的激活通路

关于SE诱导CA 1神经元坏死的机制近期已经取得了进展[4,12]。通常,坏死被认为是一种被动的死亡形式,并不需要caspases蛋白水解酶的级联激活。然而,研究表明通过启动caspase-8依赖的caspase-3激活,促成SE诱导的神经元坏死。在SE后7 h,CA 1椎体细胞出现细胞器肿胀,这是坏死的早期阶段[4]。紧接着SE后24～72 h活化的caspase-3 (caspase-3a)免疫反应性增加。光镜和电镜研究证实大多数caspase-3a阳性的CA 1神经元表现出形态学上的坏死,而且caspase-3a染色仅出现在细胞核。通过染色质染料 Hoechst 33342双标记,在CA 1大多数caspase-3a阳性的神经元有固缩核(在 24 h有98.2%),是坏死的特征。在未固定的冷冻切片上的caspase激活检测证实在CA 1损伤神经元的固缩核有caspase-3的激活。通过电镜,大多数caspase-3a免疫活性的CA1神经元有坏死的形态学特征,如细胞质和线粒体的肿胀以及核固缩[8]。但是,在 SE后 72 h,只有少数细胞检测到显著增加的活化的caspase-9免疫活性,表明内源性途径不能促使 SE诱导的 CA 1神经元坏死,外源性途径也许促使海马CA1神经元坏死。

而在齿状回神经元中,SE后 7 h和24 h,接近80%的凋亡神经元表达caspase-3a。在SE后 7 h和 24 h,接近 70%的凋亡细胞有caspase-9免疫反应性。在SE后的齿状回caspase-8的免疫反应性没有显著增加。光镜结果也显示,caspase-3a和caspase-9阳性的细胞出现大而圆的染色质团块或染色质边缘化等细胞凋亡的形态特征,以上结果表明在SE诱导的齿状回神经元凋亡过程中内源性途径起重要的作用[8]。

3 细胞成熟的水平可能决定了神经元损伤的模式和机制

研究表明有相同海马回路的出生后大脑神经元细胞中,相同的发作通过不同的机制诱导神经元死亡,原因还不确定。细胞成熟的程度也许是一个因素[13]。如在高度分化的海马CA 1椎体神经元,caspase-8上调优先于caspase-3激活和坏死,而caspase-9没有上调,这是 SE诱导成熟大脑神经元死亡的主要形式。在齿状回凋亡的神经元中观察到caspase-9和caspase-3的激活,但caspase-8没有激活。在非成熟脑的 SE模型中,嗜酸性的caspase-3a免疫活性的神经元定位在内部颗粒层,这是齿状回发育到成熟的最后的一层。同时也发现所有caspase-3a免疫活性的神经元是有双倍皮质激素免疫活性的,这是非成熟神经元的特征,并且不表达钙结合蛋白 -D28k,这是成熟齿状回颗粒细胞的一个标记[9]。有趣的是,当大脑受损伤后,发育中的大脑比成熟大脑对于正在发生的凋亡更敏感。这个现象和参与凋亡的年龄依赖的细胞死亡因子(如 caspases)的下调是相关联的[14-15]。从研究结果可以假设在决定发作对神经元的易损性时,个别神经元的成熟水平也许和整个有机体的成熟水平一样重要。

4 癫痫发作过程中细胞凋亡与一氧化氮合酶、核因子 -β的关系

越来越多的实验表明细胞凋亡在癫痫所致的脑损伤过程中发挥重要的作用。NO作为一种新型神经递质,在中枢神经系统中发挥复杂而重要的作用[16]。一氧化氮合酶(NOS)可以催化底物L-精氨酸生成NO。而NF-κβ是一类与转录活性有关的蛋白质家族。其中起主要作用的是 p65/p50异源二聚体,在胞质中p65/p50因与抑制蛋白Iκβ(inhibitory protein kappaβ)结合而失活。当细胞受到内外刺激时Iκβ被上游激酶所降解,NF-κβ被激活并转入核内,与特定的 DNA序列结合发挥对靶基因调节而起到相应作用。有研究显示NO可以通过激活一些相关的蛋白如NF-κβ等而诱导凋亡[17]。

采用戊四氮(PTZ)致痫大鼠模型的实验研究表明,癫痫发作后细胞凋亡与NO和NF -κβ密切相关。可能的机制是:PTZ作为一种兴奋性氨基酸激活N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR),使细胞内钙增加,进一步激活了依赖钙-钙调蛋白的组成型 NOS,使分泌达第1个高峰;而NO可抑制NMDAR,下调钙内流,使二者出现下降趋势,可能参与了癫痫的发生和早期脑保护;但随着惊厥时间的延长, NOS再次升高,与细胞凋亡和NF-κβ有明显的时间相关性,提示后期产生的 NOS可能是不依赖钙的诱导型一氧化氮合酶(iNOS),从而产生了过多的NO,而是通过诱导NF-κβ的产生而造成了神经元凋亡。研究者同时检测了癫痫发作过程中细胞凋亡、NOS和NF-κβp65的表达,提示 NO早期轻度表达可能与癫痫发生和早期脑保护有关,而后期的过度表达可能通过诱导NF-κβp65表达导致细胞凋亡的发生。

5 展望

总之,癫痫发作后神经元的死亡形式与损伤的强度和线粒体的功能状态有关,线粒体构成了神经元存亡的控制中心。细胞色素 C的释放和caspase的激活是神经元损伤的最后共同通路。发作损伤后凋亡信号途径促成神经元丧失,在 TLE病人中也参与颞叶结构的改变。采用鼠模型对感兴趣的靶基因的长期研究应该更进一步阐明癫痫发生和这些信号途径之间的关联性。最后,在癫痫发生过程中,凋亡信号途径中某个基因的新功能意味着表达水平和活性的改变,也许影响发作敏感性和神经元重建。

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