蛋白质降解及其产物氨基酸检测的研究进展

孙秋君，陈晓晔，朱建良

(南京工业大学制药与生物工程学院，江苏南京210009)

蛋白质降解及其产物氨基酸检测的研究进展

孙秋君，陈晓晔，朱建良

(南京工业大学制药与生物工程学院，江苏南京210009)

综述了蛋白质的降解方法，包括酸水解、碱水解、酶解以及超声辅助水解，并分析比较了每种方法的优缺点。其次从检测方法的角度综述了蛋白降解产物-氨基酸的分析检测方法，包括化学分析法、电化学分析法和分光光度法。

蛋白质，降解，氨基酸，检测

氨基酸营养已成为蛋白质营养研究的热点之一，氨基酸作为蛋白质消化的主要产物，在动物营养代谢中起重要作用。与蛋白质的吸收相比具有吸收速度快、耗能低、不易饱和等特点。从20世纪初氨基酸工业化生产以来，氨基酸生产主要有蛋白水解法、发酵法和有机合成法，在实际应用中，主要是用蛋白质水解法制备氨基酸。因为氨基酸是蛋白质的基本结构单位，各种蛋白质都含有20余种氨基酸，蛋白质由大量氨基酸通过肽键连接为大分子的物质，它们都带有不同的侧链。水解的目的就是使蛋白质中肽链断裂，生成自由的氨基酸。因此水解法是最简单最容易的制备方法［1］。

1 蛋白质的降解方法

1.1 酸水解

蛋白质的酸水解是在高温条件下用无机酸催化进行，常用的无机酸是盐酸、硫酸和甲基磺酸等［2］，其中，盐酸是最通用的水解剂，它既可以应用于液相的水解模式，也可以应用于气相的水解模式，水解过后容易蒸发除去，水解产物可以浓缩，并且只要很少的缓冲溶液就可以溶解。用盐酸水解时通常浓度为6mol/L［1］。严群芳［3］等人利用HCl水解大豆蛋白获得游离氨基酸，通过实验确定了酸浓度为6mol/L，水解时间14h，液固比为4∶1的最佳水解条件，使得氨基酸的产量达到55.74%。何强飞［4］等人采用25% HCl在温度为90℃的条件下，水解大米饲料蛋白20h，其水解率可达到52.85%。路亮［5］等人采用8N HCl对制革下脚料进行降解以获得混合氨基酸。其中，原料重∶酸用量=1∶1.2w/v，在105～110℃下水解11h，经脱酸、脱色、中和、浓缩、结晶得到氨基酸总量为35.54%。得到人体必需氨基酸为11.58%的混合氨基酸。孔薇［6］、王亚林［7］分别用盐酸对大豆饼粕和毛发进行降解，得到了相应的氨基酸。

另外，硫酸也是常用的酸水解剂。徐彭［8］等人采用硫酸水解法水解蚕蛹蛋白，得到氨基酸态氮分别为9.05%和13.45%的食用复合氨基酸粉和精制复合氨基酸粉。张寒俊［9］等人以双低油菜籽脱脂粕为原料，采用硫酸水解法制备天然复合氨基酸粉，确定最佳工艺参数为水解温度 130℃，时间2h，酸浓度6mol/L，液固比3∶1，此条件下产品得率为38.70%。王家宏［10］等人采用5mol/L的硫酸水解羽毛蛋白，工艺条件为水解时间8h，水解温度120℃，无机盐催化剂用量40g/kg，最终得到的水解液中含有17种氨基酸。

酸水解法水解迅速而彻底，无消旋作用。但是会产生大量的废酸污染环境。而酸剂的浓度、用量、水解时间、温度等都对蛋白质的水解有一定的影响。

1.2 碱水解

碱水解法通常以氢氧化钠作为水解剂。赵芯［11］等人采用氢氧化钠水解微生物蛋白得到氨基酸，在最佳水解条件下，即水解温度90℃、反应时间2h、氢氧化钠溶液浓度30%、液固比50∶1的条件下，氨基酸产生量可达39.9mg/g干菌体。韩扬［12］等人以燕麦麸皮为原料，通过碱提工艺提取燕麦麸皮蛋白。在料液比为1∶20，反应时间为2h，溶液含碱量为1.0mol/L的条件下，蛋白质的水解度达到30%左右。李远坤［13］以大麦麸皮作为原料，首先采用碱提酸沉法提取大麦麸皮中10%的蛋白质，随后利用碱解法对蛋白质进行降解，蛋白的水解度在30%左右。水解产物主要是对应分子量分别在31500u和100～200u左右的小分子物质。尹国强［14］等人先采用亚硫酸氢钠溶液对羽毛进行预处理，以缩短水解时间，随后用0.4%的氢氧化钠溶液水解已处理的羽毛粉，液固比为15∶1，反应温度为90℃，反应时间2h，在此条件下制得羽毛蛋白的降解率为65.7%。

碱水解法水解迅速彻底，蛋白质分子中的大部分氨基酸都要遭受破坏，但是色氨酸不被破坏，并且产生消旋作用，对设备的腐蚀性大，所以工业上多不采用此方法。

1.3 酶解法

蛋白质原料在一定的pH和温度条件下经蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽的过程称为酶水解法。在用酶法对蛋白质水解时所用的酶为蛋白酶，从来源上可以分为动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶。

动物蛋白酶中，胰蛋白酶和胃蛋白酶的酶解效果较好，但价格有些高。徐娟［15］等人选用胃蛋白酶对绿豆分离蛋白进行酶法水解，在沸水浴中90℃处理20min，在37℃、pH1.8、底物质量分数7%、酶量6000U/g条件下酶解180min，水解度为19.86%。盛家荣［16］等人利用胃蛋白酶水解板蓝根多糖中的蛋白质，通过考察pH，胃蛋白酶用量，反应温度和反应时间4个因素确定去除蛋白的最佳工艺，使得水解液中多糖的含量达到87.7%。姜莉［17］等人利用胰蛋白酶水解核桃蛋白，在反应时间4.0h、底物质量浓度27g/L、温度53.4℃、pH8.0、加酶量(E/S)8.3g/kg的条件下，水解度可达14.497%。

在植物蛋白酶中，以木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶应用较多，但反应周期较长，水解效率低，易受外界影响。陈彦平［18］、左继红［19］、王辰［20］等人以木瓜蛋白酶分别对玉米胚芽蛋白、大豆蛋白和螺旋藻蛋白进行水解，都得到了较高的水解率。

微生物蛋白酶活性较高，用于酶解法的主要有中性蛋白酶和碱性蛋白酶。刘新华［21］等人利用碱性蛋白酶水解玉米蛋白，实验结果表明，在pH10.5、酶解温度60℃、酶与底物比5%、底物质量分数8%的条件下酶解4h，可使水解度和氮溶解指数分别达到49.7%和51.2%。车有荣［22］利用中性蛋白酶对花生粕蛋白进行降解，实验结果表明:花生粕水解产物的氨基酸组成完全，且人体所必需的8种氨基酸含量较高。

靳挺［23］采用复合酶(Alcalase碱性内切蛋白酶和Flavourzyme风味蛋白酶)水解鱿鱼蛋白，结果表明，Flavourzyme能有效提高鱿鱼蛋白的水解度，在优化的水解条件下，鱿鱼蛋白水解度达20.11%，水解产物的平均分子量为1180u，约由9.2个氨基酸残基组成。水解产物中必需氨基酸含量占氨基酸总量的38.4%，天冬氨酸和谷氨酸等鲜味氨基酸占氨基酸总量的26.3%。

酶水解法的优点为反应条件温和，无消旋作用。但是，酶解法水解不彻底，产物中除氨基酸外，含有较多的肽类。

1.4 微波辅助水解法

微波是一种高频电磁波，微波能够透射到生物组织内部使偶极分子和蛋白质的极性侧链以极高的频率振荡，引起分子的电磁振荡等作用，增加分子的运动，导致热量的产生。微波的能量可以大大缩短完全水解的时间。

微波辅助水解法在酸解、酶水解方面都有着一定的应用［24］。Zhong Hong-ying等［25］用6mol/L HCl处理细胞色素C等蛋白质，在微波辐射下水解30～90s，得到专一的多肽。Lin Hua等［26］用2%甲酸水解肌球素将牛血清白蛋白降解成多肽，而且不需要净化就可以进行质谱检测。

蛋白质酶促水解反应是制备生物活性多肽的一种有效方法。微波辐射水解的效率都高于常规酶水解，这是因为常规方法所需时间长、升温慢，这些都会导致酶失活;而微波加热可以在短时间内达到很高温度，在酶彻底失活之前就完成水解反应。Juan Hsueh-fen等［27］对蛋白质凝胶水解进行研究，经凝胶处理的五种蛋白质分别在常温下反应16h及195W微波辐射5min，随后进行二维电泳及质谱分析，结果表明微波方法优于常规方法。Vesper H W等［28］在不同温度、缓冲溶液浓度和水解时间条件下，对胰蛋白酶及蛋白内切酶催化水解进行了全面的研究，胰岛素在50℃，20min的水解效率比常规方法高20%，蛋白内切酶稳定性随着温度提高而下降，导致其水解效率降低。

2 氨基酸的检测方法

蛋白质经过降解得到氨基酸，其种类以及含量便成为人们研究和关注的热点。

1985年Spackman［29］等首次报道了氨基酸自动分析方法，经过50多年的发展，氨基酸分析方法得到不断的改进和完善，由最初的阳离子交换色谱分离-柱后茚三酮衍生化方法发展为多种分析方法并存，互相取长补短［30］。氨基酸分析，按分离方法可分为纸色谱法、离子交换色谱法、反相高效液相色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法、气相色谱法等;按检测方法分可分为化学分析法、电化学方法(包括电导检测、安培检测)、分光光度法(包括可见光分光光度法、紫外光分光光度法和荧光分光光度法)等;按衍生反应的先后可分为柱前衍生和柱后衍生法。氨基酸是一类化学性质相似的生物活性物质，在分析过程中，检测方法的灵敏度对分析的准确性起非常重要的作用［31］。

2.1 化学分析法

2.1.1 甲醛滴定法 甲醛滴定法［32］用于氨基氮的测定，可以测出样品中总氨基酸的含量，但是该法准度差，终点较难掌握。徐勤［33］采用甲醛法测定大豆蛋白的水解度，实验结果显示甲醛法测得的结果与文献报道基本一致。姚玉静［34］对比了甲醛滴定法和pH-stat法对大豆蛋白水解度测定的差异。结果表明，采用内切蛋白酶对蛋白进行水解时，pH-stat法和甲醛测定结果较为接近;而采用富含外肽酶的蛋白酶对蛋白质进行水解时，采用pH-stat法测定水解度会导致水解度偏低。

2.1.2 凯氏定氮法 凯氏定氮法［35］是用于测定样品中总氮的含量，然后根据蛋白质和氨基酸中的氮含量，从而得知含氮的氨基酸、蛋白质的总量，该方法准确度高，但是操作步骤复杂、试剂耗量多、测定周期长。

2.2 电化学分析法

采用适用于不同氨基酸的选择电极，可对各种氨基酸进行测定［36］，电导检测和安培检测的方法，也被人们广泛应用于氨基酸的分析［37-38］。电化学分析的最大优点在于无需衍生反应，操作简便，它与各种现代化的分离方法相结合可以大大简化操作过程，节约分析时间。

2.3 分光光度法

大多数氨基酸对紫外和可见光的吸收很弱或无吸收，所以通常利用氨基酸分子中的氨基、羟基或其它活性基团与衍生化试剂反应，生成具有可见光、紫外生色团或能产生荧光的衍生反应产物，然后用可见光、紫外或荧光检测器进行检测［24］。

2.3.1 可见光检测 通常能使氨基酸在可见光区有吸收的衍生试剂有茚三酮、磺酰氯二甲胺偶氮苯(DABSYL-Cl)等。氨基酸与茚三酮经加热反应后，一级胺与之生成蓝紫色化合物，二级胺与之生成黄色化合物。两种衍生物检测波长分别为570nm和436nm［38］。邵金良［39］利用茚三酮法检测茶叶中游离氨基酸的总量。实验结果表明，pH8.0、沸水浴加热15min、冷却10min后在最大吸收波长570nm处测定，该方法的变异系数小于1.69%，加标平均回收率为96.33%。周国兰［40］以2%的茚三酮溶液作为显色剂，pH8.0的磷酸盐作为缓冲溶液，在570nm处测得茶叶中游离氨基酸的含量。茚三酮衍生显色反应的灵敏度可达2×10-10～5×10-10mol/L，衍生物稳定性较好。其缺点是衍生反应条件较高，需附加温衍生装置，体系平衡时间长［41］。

2.3.2 紫外光检测 紫外光检测，是通过氨基酸与衍生试剂发生化学反应，生成的氨基酸衍生物在紫外光光谱范围内有吸光度值。通常使用的衍生试剂包括邻苯二甲醛(OPA)［26］、异硫氰酸苯酯(PITC)、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯［24］。

2.3.2.1 邻苯二甲醛(OPA)法 OPA作为衍生试剂，虽然衍生反应非常快速，但有较强的选择性，只能用于一级氨基酸的衍生，且衍生物的稳定性较差。刘春兰［42］利用邻苯二甲醛(OPA)-柱前衍生反相高效液相色谱法测定了海洋胶体重的氨基酸组成和含量，检出限为2×10-3～9×10-3μmol/L，相对偏差为3.4%～10.7%。该海洋胶体中含有16种氨基酸，总量为150.83μmol/L。肖礼娥［43］同样利用OPA柱前衍生法测定醋粉中氨基酸的含量，结果表明各种氨基酸能达到基线分离。

2.3.2.2 异硫氰酸苯酯(PITC)法 异硫氰酸苯酯(PITC)和氨基酸的反应产物苯基硫酸盐-氨基酸具有稳定性，且PITC与氨基酸和亚氨基酸均能反应，衍生物稳定性好。吕艳［44］采用异硫氰酸苯酯柱前衍生法分析多肽中18种氨基酸组成。检测乳品中谷氨酰胺含量时，韩立强［45］通过谷氨酰胺与双(1，1-三氟乙酸基)碘苯(BTI)反应后酸水解，再用异硫氰酸苯酯衍生后，用HPLC检测。结果发现，此方法能够对乳品中的Gln进行很好的定量。

2.3.3 荧光检测 荧光检测法，是通过使氨基酸与衍生试剂发生化学反应，生成的氨基酸衍生物能够用荧光分光光度计分析，从而得知被测氨基酸的含量。通常，衍生试剂包括邻苯二甲醛(OPA)、丹酰氯(DANSYL-Cl)、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)［46］。

2.3.3.1 邻苯二甲醛(OPA)OPA衍生法可以快速与氨基酸反应生成发荧光团物质，并在很短的时间内进入灵敏度很高的荧光检测器检测。邓樱花［47］利用OPA衍生法检测了七种神经递质氨基酸，待测氨基酸与衍生剂反应1min便可进行分析检测。桂莉［48］也采用 OPA法测定微透析液中天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、γ-氨基丁酸(GABA)的含量。结果兴奋性Asp、Glu及抑制性Gly、GABA在18min内完全分离，在0.625～5μmol/L浓度范围内与峰面积有良好的线性关系。

2.3.3.2 氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl) 在pH为7.7时反应生成稳定衍生物，一级、二级氨基酸全可检测，荧光检测灵敏度可达1×10-15mol水平。但是FMOC -Cl与His形成单、双衍生物的比例不稳定，影响定量;FMOC-Cl及其水解产物FMOC-OH有荧光干扰［41］。

3 结语

蛋白质水解是制备氨基酸最简单最容易的方法，不同的水解方法对于氨基酸含量的获得有不同的影响，酸水解和碱水解蛋白质能够快速获得产物，但是对氨基酸的种类和环境都有一定影响。酶水解蛋白质具有安全、高效的优点，但是其成本较高。

上述各种氨基酸的分析方法各具特点，采用何种方法，需根据实验条件、分析速度、检测灵敏度、干扰因素、样品的种类等各项指标与实际要求做出选择。

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Research of protein degradation and amino acid detection

SUN Qiu-jun，CHEN Xiao-ye，ZHU Jian-liang
(College of Life Science and Pharmacy，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China)

Methods of protein degradation were summaried，including acid hydrolysis，alkaline hydrolysis，enzymatic and ultrasound-assisted hydrolysis，and comparing the advantages and disadvantages of each method.Then methods of amino acid detection were summaried from the angle of detection，including chemical analysis， electrochemical analysis and spectrophotometry.

protein;degradation;amino acid;detection

TS201.2+4

A

1002-0306(2011)11-0525-04

2010-10-13

孙秋君(1985-)，女，硕士研究生，从事可再生能源利用的研究。