用于人胚肺二倍体细胞培养的MEM产品比较试验

李宏涛

(无锡市美迪生物制品有限公司 江苏 无锡 214000)

近几年随着国产细胞培养基的广泛应用,所占市场份额也逐步扩大,大多数生物制品企业已逐步认可了国产细胞培养基的质量[1～2]。目前,仅有小部分产品尚未实现替代。最典型的例子就是日本日水公司生产的MEM。该培养基现主要用于人胚肺二倍体细胞的培养。人胚肺二倍体细胞是甲肝疫苗、水痘疫苗、风疹减毒活疫苗、脊髓灰质炎疫苗、成纤维细胞干扰素等产品的生产用细胞[3～6],所用细胞培养基均为MEM。据长春生物制品所和长春长生生物技术有限公司介绍,他们均使用日水公司MEM生产甲肝疫苗。近来也试用过其他公司(包括一些知名外国公司)生产的细胞培养基,效果均不理想。但日水公司MEM中含有抗生素卡那霉素,而国家食品药品监督管理局在2009年第6号公告“关于进一步规范生物制品质量控制要求的通告”中已明文规定生物制品生产中应尽可能避免使用抗生素。为此,寻找替代日水公司MEM细胞培养基的工作已成必然。我们将无锡美迪生物制品有限公司的用于二倍体细胞培养的2种MEM与日水公司MEM做了比较,获得较满意的结果。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用培养基为无锡市美迪生物制品有限公司生产MEM(不含硫酸卡那霉素)批号091028;日本日水公司MEM批号606903;杭州四季青小牛血清批号090411-3;Sulforhodamine B(sigma);三氯乙酸、乙酸、三羟甲基胺基甲烷均为分析纯;台盼蓝(sigma);酶联免疫检测仪3022A(华东电子管厂);96孔细胞培养板(Falcon 3072);方瓶(corning)。

1.2 细胞

试验所用人胚肺二倍体细胞2BS株由长春长生生物科技有限公司甲肝疫苗室提供,代次为33代。

1.3 方法

1.3.1 培养液配制 将2种培养基干粉按说明书溶解于三蒸水中,高压灭菌后,冷却至室温;加入29.3mL/L的7.5%无菌碳酸氢钠溶液和10mL/L的0.2mol/L无菌谷氨酰胺溶液,混匀。生长液和维持液分别加入小牛血清10%和2%。

1.3.2 细胞复苏 从液氮容器中取出冻存管,于37℃温水中速融。用吸管吸出细胞悬液至离心管中,滴加10倍以上生长液,混匀;1000rpm离心5min;弃上清液,加入生长液重悬细胞;计数后调整细胞密度,接种至培养瓶,37℃培养箱静置培养;次日更换1次培养液,继续培养。

1.3.3 细胞生长动力学实验 (1)方瓶培养用于观察细胞形态并计数。将复苏好的2BS细胞经计数后,按3.5×104cells/cm2接种细胞在150mL培养瓶中,加入20mL培养液,置于37℃培养箱中培养。分别在培养12、24、36、48、60h和72h观察细胞形态。用0.25%胰蛋白酶消化细胞后计数细胞数量。将细胞悬液0.5mL加入试管中,加入0.5mL0.5%台盼蓝溶液染色2～3min,吸取少许悬液涂于载玻片上,镜下取任意视野计数200个细胞。死细胞能被台盼蓝染上色,镜下可见深蓝色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。计算活细胞率=(未着色细胞数/200)×100%。(2)96孔板培养用于比较细胞生长周期。以10000个细胞/孔接种于96孔细胞培养板,加入不同MEM培养液,于37℃培养箱中培养。分别于12、24、36、48、60、72h取出培养板,于每孔加入50uL在4℃预冷的50%三氯乙酸,静置5min后移入4℃冰箱中静置1h,取出用水洗5遍,空气中完全干燥,每孔加入0.4%的SRB 100uL,染色20min后倒掉染液,用1%乙酸洗5次,去除未结合的染料。空气中干燥后用pH10.5的10mmol/L Tris液150uL溶解,在平板振荡器上振荡5min,在酶标仪上测定各孔在515nm的光吸收A,比较细胞生长周期。(3)细胞维持能力比较。细胞在生长液中培养72h之后,更换含2%小牛血清的维持液,置35℃恒温箱中继续培养72h,观察细胞形态并计数。

2 结果

2.1 2种培养液下细胞生长过程中的细胞形态、细胞生长周期

二倍体细胞2BS株在2种MEM培养液中,分别培养12、24、36、48、60h和72h,在显微镜下观察比较细胞生长形态,细胞在贴壁、伸展、联网以及单层等各生长阶段形态相似,均无显著差异。经胰蛋白酶消化后,计数收获的平均细胞数量分别为(105cells/mL)2.35、3.68、5.65、7.66、9.92、11.2和2.31、3.79、5.42、7.35、9.62、11.0,经统计分析,2种培养基下培养的细胞生长速率基本相同,两者无显著差异(P＞0.05)。

2.2 2种培养液下细胞活性比较

用2种培养液连续传3代细胞,考察2种培养基对细胞活性的影响。每次传代同时留取细胞悬液,用血球计数板在显微镜下计数,每次计数10个板,记录平均值;用台盼蓝拒染试验测定活细胞数量。计算平均活细胞率分别为96.8%、97.3%、97.1%和96.6%、97.8%、97.4%。统计分析,2种培养基均能使细胞保持较好的活力,P＞0.05无显著差异。

2.3 2种培养液对细胞的维持能力

考察2种培养基营养物质及缓冲系统对细胞维持的影响。细胞在2种生长液中培养72h之后,培养液pH分别为7.07和7.04,细胞均形成致密单层;更换含2%小牛血清的维持液,置35℃恒温箱中维持培养72h,测得维持液pH分别为7.15和7.12,细胞形态无差异;继续维持48h,pH分别为6.98和6.96,2者均有少量圆缩细胞出现。试验表明两种MEM都可在低血清条件下维持培养2BS细胞120h以上,且细胞形态无显著差异,培养液缓冲能力基本相同。

3 讨论

人胚肺二倍体细胞相对于其他哺乳动物细胞而言略显娇气,表现为消化时间长短以及使用的消化液种类对细胞后期增殖影响较大。开始阶段我们使用EDTA进行消化,细胞状态一直调整不好;后改用胰蛋白酶进行消化才解决了这一问题。因此如何掌握好二倍体细胞的传代消化应值得注意。细胞按1：3传代培养3～4d后形成单层;但若以1：5传代则细胞不易连接成片,容易导致空洞产生。本实验未发现卡那霉素对二倍体细胞增殖有何影响,但对病毒繁殖是否存在影响还有待探究。美迪公司MEM和日水公司MEM在人胚肺二倍体细胞培养过程中,细胞贴壁时间、细胞形态、分裂速度、增殖数量、维持时间等均无明显差异,完全可以支持人胚肺二倍体细胞的生长。

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