食源性致病菌活菌检测技术研究进展

邱 杨，田 聪，余以刚，肖性龙，李聪聪，刘建丽，赵 丽，梅艳群

（1.东莞出入境检验检疫局，广东东莞 523072； 2.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640）

近年来，国内外食源性疾病事件频频发生，对食源性疾病的预防与控制已引起了世界各国关注。提高食源性致病菌活菌检测方法的速度、效率和灵敏度尽管不能完全解决食品安全问题，却可以起到预防与控制食源性疾病的作用。在自然环境中，微生物以多种生理状态存在：可培养的活菌，活的非可培养状态（VBNC），具有完整结构但无生物活性的死菌（Ghosts）以及细胞膜损伤死菌（Membrane compomised）。如何区分活菌与死菌，致病菌与非致病菌所造成的污染是有效检测食源性致病菌的关键环节。传统检测方法把细菌是否可培养作为判断的标准，实际操作中可能会发生漏检等情况。随着研究的不断深入，活菌的快速检测新技术不断出现，人们将细胞是否具有新陈代谢活性进而产生生物活性物质，或是是否具有完整的细胞结构作为判断活菌的标准。下面主要对食源性致病菌活菌检测最新研究作一概述。

1 以可培养作为活菌标准的检测方法

传统培养法被认为是食品检测的“金标准”，在食品微生物分析中需要多步完成（如前增菌，选择性增菌，分离纯化），再用生物化学，分子生物学检测进一步确认。

培养法程序繁杂、耗时长，样本中可能含有杂菌而产生竞争性抑制，或者由于存在干扰性物质而使细菌培养不出来，使得阳性检出率受到很大影响，不能满足市场快速准确的要求。同时，培养法敏感，但检测培养法的真正的敏感性和特异性存在着无可靠参比对照系统的困难，也存在对持留菌、休眠菌及代谢异质菌无法成功培养的缺陷[1]。

2 以新陈代谢活力作为活菌标准的检测方法

2.1 ATP生物发光法

细胞内源性ATP含量可以反映细胞的活性和活细胞的数量。微生物细胞释放出的ATP与荧光素在镁离子和萤火虫荧光素酶的催化作用下可以产生荧光，荧光强度与ATP含量成正比。同时ATP含量与活的微生物数量直接相关，通过荧光检测仪可以利用发光强度来间接测定活菌总数。唐倩倩等[2]建立了E.coliO157:H7与光源计数值的定量线性模型，证明ATP生物发光法与传统的细菌培养方法有良好的线性，相关性，R2=0.9608，P<0.001。ATP生物发光法检测限比一些致病菌的致病浓度高，免疫磁分离技术与ATP生物发光法相结合可以提高检测的灵敏度，这种方法当前已经成为研究热点。

由于ATP生物发光法简单快速，被广泛的应用于食品卫生、化工、环境等领域。但是，ATP生物发光法只能用于细菌总数的快速测定，不能用来鉴定菌种。而且，ATP生物发光法中涉及ATP的提取和酶促反应，使得检测结果受到多种因素的影响。在检测实际食品样品时，食品中含有的其他生物游离出来的ATP可能干扰总ATP含量的测定。另外，缓冲液种类、盐、pH、温度等因素对生物发光反应有一定的影响。

2.2 生物传感器

微生物的代谢过程和基质氧化还原机理会产生代谢产物如酶、抗体、色素等可用于检测和识别的物质，或者使培养基的电化学性质如电流、电阻和电导等发生变化，可以检测分析电化学参量的变化。目前，基于光效应、热效应、场效应和反应物质量变化有各种生物传感器。Su等[3]根据共振频率和电阻的变化（△F和△R）利用连有固定化的沙门氏抗体石英晶体微天平（QCM）免疫传感器检测沙门氏菌，经过阻抗分析仪检测电导率和电纳，结果表明共振频率和阻尼的变化与鸡肉样品中鼠伤寒沙门氏菌的浓度相关，根据阻尼的变化可以检测到最低限量为100 cell/mL沙门氏菌。

不同类型的生物传感器具有各自独特的优点，但又存在各自的局限性。生物传感器本身不能鉴定菌种，常常需要和其他的检测方法联合使用，基于免疫原理的生物传感器是当前在利用传感技术检测活菌的研究热点。随着技术的不断革新，生物传感器将会成为一种快速检测微生物的有效手段。

2.3 免疫学技术

免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法，其基本原理是抗原抗体反应。酶联荧光免疫分析技术（enzyme-linked fl uorescent immunoassay，ELFIA）是将酶系统与荧光免疫分析结合起来，在普通酶免疫分析的基础上用理想的荧光底物代替生色底物。孙素霞等[4]以常规细菌培养法（GB 4789.30-2003）作为参照，对自动酶联荧光免疫分析系统（VIDAS）进行评价，最终根据荧光计数仪记录所产生的荧光强度计算所测物质浓度，冻肉李斯特氏菌检测的灵敏度为100%，特异度为90.9%。

免疫学技术具有准确性高、检测速度快等优点。但是，单克隆抗体制备比较困难，容易产生交叉反应，存在抗体与非抗原物质之间的非特异性反应，由于灵敏度低，需要经过必需的富集步骤。在实际操作中，常常和其他技术交联使用。

2.4 mRNA检测法

细菌中的DNA是稳定的核酸分子，存在平台效应，死菌中的DNA降解较慢，不能作为判断细菌活的标志。但细菌中mRNA仅存在于活的、有代谢活性的菌体中，在细菌死后很快降解，可以较好地作为活菌的指示标志。李善志等[5]采用以mRNA为基础的RT-PCR方法对单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA基因进行检测，较好地扩增单核细胞增生李斯特菌的特异性片断，检测的灵敏度纯菌可达到1×104cfu/mL，人工污染样品猪肉、虾肉和牛奶等培养12～16 h，可达4.5 cfu/mL。

近些年还出现不需要温度循环仪的核酸等温扩增方法，如链置换扩增法、滚环扩增法、核酸等温扩增法等，被应用于病原菌诊断、食品致病菌检测等领域的研究。由于提取RNA比较复杂，且RNA易降解，RNA提取过程中要极力避免外源RNA酶的污染和尽力控制内源性RNA酶的活力。以mRNA为基础的RT-PCR方法不能够完全区分死菌与活菌，且检测灵敏度受到mRNA提取不稳定的限制。

2.5 其它检测法

基于新陈代谢活力检测活菌的方法还有检测代谢糖类产CO2的放射测量技术等其它的技术。由于化学分析技术的不断发展，分析微生物的特异性化学标志成分的气相色谱、高效液相色谱、毛细管电泳和质谱等仪器分析的方法开始运用于微生物的检测当中来，在国内的应用相对较少，有广阔的发展空间[6]。

3 以细胞膜完整性作为活菌标准的检测方法

3.1 死菌/活菌荧光染色技术

荧光染料由于灵敏度高、操作方便，已作为检测标记应用于活菌检测。核酸荧光染料种类较多，有DNA染料和RNA染料，有活细胞染料和死细胞染料，还有核酸复染染料等。

Olga等[7]将死菌/活菌荧光染色技术和荧光原位杂交技术（LDS-FISH）联合使用，检测水中的Bacteroides spp.存活量，使用SYTOX Green作为荧光染料使16S rRNA染色，利用LDS-FISH法分析混合的微生物菌群中一种目标菌，结果表明这种方法是一种快速有力的工具检测饮用水中的活菌数量，克服了死菌/活菌荧光染色技术单独使用不能鉴定菌种的缺陷。

3.2 流式细胞术

流式细胞术（flow cytometry）也称荧光激活细胞分类术，是一种在功能水平上对单个细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。李影等[8]用流式细胞仪和荧光染色联合对经酸和低温联合诱导的大肠杆菌活的非可培养状态（VBNC）进行检测。流式细胞仪分析结果表明，当可培养菌数降为零时，与正常状态细菌相比，诱导后菌株多数仍为呈现绿色荧光的活菌，活菌数远远超过死菌数，结合荧光图像可以确知菌体形态。

流式细胞仪和荧光染色联合能够客观评价细菌的活性状态，较准确地分析出活死细菌的数量或两者数量的比例关系。但是，流式细胞术无法鉴定和识别某一具体的微生物。尤其是处于VBNC状态的未可培养细菌，流式细胞仪分析样品所需的荧光染料较多、剂量较大、价格昂贵，不适于大批量样品的检测。

3.3 荧光定量PCR法

荧光染料作为前处理手段，结合qPCR技术用于活菌检测已经取得大量的研究进展，并且具有广阔的潜在应用空间。EMA是一种选择性核酸交联染料，可以透过死细胞而不能透过活细胞的细胞膜，进入细胞后，EMA与DNA共价结合，从而阻碍了死细胞中目标DNA的扩增。Andreas等[9]利用EMA对细菌进行预处理后，分别用微阵列技术和qPCR技术检测活菌数，并对二者结果进行比较，发现两种方法都可以有效检测出样本中的活菌含量，结果高度一致。PMA为荧光染料PI的结构类似物，用于活菌/死菌检测时与EMA的作用原理相似。但是二者穿透细胞的能力有较大区别。Tomas等[10]利用PMA-qPCR方法定量分析检测乳制品中的四种乳酸菌，4℃储存的发酵牛奶被用来检测，PMA-qPCR的结果与平板技术的结果很接近（P＜0.05），且检测可在3 h内完成。

利用定量PCR能准确定量、灵敏度较定性PCR明显提高。但EMA/PMA qPCR法也存在着一些不足和缺陷，对于一些可逆性的部分膜损伤细胞以及部分膜完整的活菌，染料仍会进入细胞，产生假阴性结果。与培养法相比，假阳性结果造成活菌数量被高估也是主要存在的问题[11]。

4 结语

食源性致病性活菌检测技术在不断的发展和创新中，每种方法都有各自的优势，然而随着技术的不断进步，缺陷和不足也逐渐暴露出来。一些技术的交联使用可以克服检测中的缺陷，国内外的研究人员一直在朝着快速、高效、准确、简便的目的改进和完善已有的检测方法。随着科技的进步，将会有越来越多的食品微生物分析方法和技术应用到生产实践和生活中。

[1]陆宇，朱莉贞，段连山，等.mRNA作为结核分支杆菌活菌检测标志的可行性研究[J].中华结核和呼吸杂志，2003，26（7）：419-422.

[2]唐倩倩，王剑平，盖玲，等.ATP生物发光法检测E.coliO157:H7的研究[J].光谱学与光谱分析，2009，29（2）：309-312.

[3]Su X L，Li Y A.QCM immunosensor for Salmonella detection with simultance measurements of resonant frequency and motional resistance [J]. Biosens Bioelectron，2005，21（6）：840-848.

[4]孙素霞，陈思强，罗海吉.自动酶联荧光免疫分析系统检测冻肉中李斯特氏菌[J].南方医科大学学报，2006，26（9）：1325-1326.

[5]李善志，吴清平，张菊梅，等.RT-PCR方法检测单核细胞增生李斯特活菌研究[J].中国卫生检验杂志，2006，16（6）：641-643.

[6]缪佳铮，张虹.仪器分析方法在食品微生物快速检测方面的应用[J].食品研究与开发，2009，30（3）：166-169.

[7]Olga S，Noriko O，Tsukasa I，et al. Application of a direct fl uorescence-based live/dead staining combined with fl uorescence in situ hybridization for assessment of survival rate of Bacteroides Spp.in Drinking Water[J]. Biotechnology and Bioengineering，2005，92（3）：355-363.

[8]李影，王伟利，段冶，等.流式细胞仪检测活的非可培养状态大肠杆菌[J].中国动物检疫，2009，26（12）：34-36.

[9]Andreas N，Alberto M，Luke M，et al. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology[J].Journal of Microbiological Methods，2009，76（3）：253–261.

[10]Tomas G C，Raquel T，Carmen P，et al. Simultaneous detection and enumeration of viable lactic acid bacteria and bifid bacteria in fermented milk by using presidium monoazide and realtime PCR [J]. International Dairy Journal，2009，19（6/7）：405-409.

[11]Fittipaldi M，Codony F，Adrados B，et al. Viable Real-Time PCR in Environmental Samples：Can All Data Be Interpreted Directly [J].Microbial Ecology，2011，61（1）：7-12.