马尔堡病毒核蛋白的原核表达及纯化

王皓婷 ，王水明 ，史子学 ，邵东华 ，魏建超 ，刘学辉 ，王志亮 ，王雪敏 ，马志永

（1.中国农业科学院上海兽医研究所兽医公共卫生研究室，上海 200241；2.河北工程大学农学院，河北 邯郸056001；3. 南京出入境检验检疫局，江苏 南京 211106；4. 中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266114）

马尔堡出血热是由马尔堡病毒引起的一种致死率极高的烈性传染病。最早有关马尔堡出血热爆发的记录是在1967年德国马尔堡。据报道当时有31人感染病毒发病，其中7人死亡。这31个感染病毒的人中有25人是由于接触了感染马尔堡病毒的猴子而致病的[1]。马尔堡病毒可由人与人之间的亲密接触传播，传染性强。目前尚没有有效的疫苗和特效的治疗药物。

感染马尔堡病毒后，潜伏期约为5天，发病后症状表现为发烧、浑身发冷、头痛、肌肉痛。随后有些人会出现皮疹的症状，大部分人会有恶心、呕吐、腹泻、骨头疼痛及腹痛等症状。随着时间的推移，症状可能会越来越严重，最终导致大量出血及多器官功能障碍[2]。大多数病人在感染病毒后的两周内会死亡。病毒可通过人与人之间的直接接触而传播，也可通过接触马尔堡出血热患者的体液或遗骸而使健康人感染[3]。到目前为止，该病毒的自然宿主尚不能确定，但多数学者怀疑与蝙蝠有关[4-5]。

马尔堡病毒和埃博拉病毒共同构成丝状病毒属，但属两个不同的种系[6]。马尔堡病毒只有一种血清型。在电子显微镜下观察呈不同的形态，多为长细丝状，也有时呈卷曲的蚯蚓状或6形、环形。病毒颗粒直径较一致，约80～100 nm，但长度差异较大，一般为 300～1500 nm，病毒表面有一层蛋白包膜，具有抗原性[7-8]。马尔堡病毒基因组全长约19 kb，为单股负链RNA病毒。基因组编码7种病毒蛋白，包括核蛋白（NP）、基质蛋白 VP24和VP40、结构蛋白 VP30和VP35、依赖RNA的RNA多聚酶（L蛋白）、糖蛋白7（gp7）[9]。由于核蛋白有很强的抗原性，故将核蛋白亚克隆入原核表达质粒。成功表达后，利用His-Band Ni+柱进行亲和层析纯化，获纯化蛋白，用于后续研究。

1 材料和方法

1.1 实验材料

原核表达质粒 pET-28（a）、大肠杆菌 DH5 α、BL21（DE3）菌体、IPTG、抗生素等由本实验室保存；各种限制性内切酶购自大连宝生物公司；T4连接酶购自Invitrogen公司；His Bank Kits蛋白质纯化试剂盒购自Novagen公司；普通质粒小量提取试剂盒和DNA片段胶回收试剂盒购自博大泰克生物技术公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠二抗为美国Sigma公司产品；其他试剂均为国产分析纯；马尔堡病毒核蛋白基因（GenBank No： Z29337.1）由南京金思特科技有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 基因克隆与原核表达载体的构建

在基因合成前的设计阶段，将HindⅢ和EcoRⅠ的酶切位点插入到马尔堡病毒NP基因的两端。合成的NP基因克隆至pUC57质粒中。对PUC57-MNP质粒进行HindⅢ和EcoRⅠ的双酶切，酶切完毕后对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒回收约2100 bp的目的片段，将回收产物亚克隆入pET-28（a）载体，构建 pET-28（a）-M-NP 重组质粒。

重组质粒构建好后，按常规方法转化感受态E. coli DH5α，涂布卡那霉素抗性平板，挑单克隆摇菌12 h后，提取质粒，用HindⅢ和 EcoRⅠ进行双酶切，酶切产物经琼脂糖电泳进行分析鉴定。将阳性重组质粒送往上海桑尼公司进行目的片段的序列测定。

1.2.2 目的基因的诱导表达

将重组质粒用热休克法转化感受态细菌E.coliBL21（DE3），挑取单克隆培养，37 ℃振荡培养12 h后，按1:100 比例转种，接种100 mL含有卡那霉素（终质量浓度为50 g/mL）的LB液体培养基，37 ℃振荡培养3 h。3 h后以终浓度0.5 mmol/L 的IPTG诱导目的蛋白表达。诱导表达4 h后，以12000 r/min转速，离心5 min收菌。菌体沉淀用20 mL裂解buffer重悬，置于摇床中振荡裂解1 h。1 h后超声冰浴破菌。裂解后的菌液，在4 ℃下以5000 r/min离心10 min，将离心后的沉淀和上清分别收集并分别制备样品，以10%SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况。沉淀用8 ml含6M尿素的1×Binding buffer重悬，置4 ℃过夜。

1.2.3 表达产物的纯化

将诱导后表达的蛋白用His-Band Ni+柱进行亲和层析纯化，8%SDS-PAG检测纯化效果。

1.2.4 融合蛋白的Western-blot分析

按照常规方法进行Western-blot分析，一抗为His抗体，稀释度为1:3000。二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，稀释度为1:5000。具体步骤参照《分子克隆试验指南》。

2 结果

2.1 原核重组表达载体pET-28（a）-M-NP的构建和测序

马尔堡病毒NP基因全长2088 bp，亚克隆入pET-28（a）载体，对重组质粒进行HindⅢ和 EcoRⅠ的双酶切。以1%琼脂糖凝胶电泳分析双酶切产物，在与预期相符的约2100 bp 处有特异性条带（图1），表明马尔堡NP基因已成功克隆到原核表达质粒。将重组质粒送往上海桑尼公司进行序列测定后，结果表明目的片段序列正确没有突变。

2.2 重组蛋白的表达

将鉴定后序列正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），以终浓度1 mmol/L的IPTG诱导6 h，诱导前后分别取1 mL菌液制样，以10%SDS-PAGE电泳鉴定后，证明目的蛋白成功表达（图2）。

将pET-28（a）诱导后，pET-28（a）-M-NP诱导前后，超声后离心的上清和沉淀分别制样，10%SDS-PAGE检测表达情况。图3表明重组蛋白在上清沉淀中均有表达。上清在非变性条件下，沉淀在变性下分别纯化。

2.3 NP重组蛋白的纯化

用含6M尿素的1×Bingbuffer将超声裂解后离心的沉淀重悬过夜，在变性条件下用His-Band Ni+柱进行亲和层析纯化。将破菌上清在非变性条件下用His-Band Ni+柱进行亲和层析纯化，10%SDS-PAGE检测纯化结果（图4）。

2.4 重组核蛋白的Western-blot分析

融合蛋白带有His标签，以Anti-His单克隆抗体对重组核蛋白进行Western-blot分析发现，在约97KD处有特异性反应条带显现（图5）。说明融合蛋白可以与Anti-His单克隆抗体发生特异性反应。

3 讨论

感染病毒的非人灵长类动物和病人是主要传染源，且症状越重的患者传染性越强，潜伏期的患者传染性较弱。目前我国境内尚无此病症，但由于此病的危害性较大，建立完善检测方法是当务之急。

本实验利用大肠杆菌表达系统获取重组蛋白。大肠杆菌表达系统虽不能完全真实反映蛋白的天然构象，但由于此方法操作简便成本低廉，便于大规模生产。大肠杆菌表达系统的产物易于纯化且无感染性[10]。

为了便于目的蛋白的纯化，在重组表达外源蛋白时引入His标签。His标签有表达方便不影响蛋白活性等优点。本实验选用大肠杆菌表达系统以及His标签作为目的蛋白的纯化标签，所得到的重组蛋白可用于后续检测方法的研究。

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