羊水栓塞孕鼠血清类胰蛋白酶的变化及意义

侯志刚，宋子亨，赵 敏，余 舰，税 兰

（1.风冈县人民医院，贵州风冈564200；2.遵义医学院法医学系，贵州遵义563000；3.遵义医学院附属医院，贵州遵义563000）

羊水栓塞（Amniotic Fluid Embolism，AFE）， 是指在分娩过程中由于羊水进入母血循环而引起的肺栓塞、休克等一系列严重症状的综合症，是导致孕产妇猝死的主要原因之一[1]。自1926年第一次正式报道AFE以来，它已成为孕妇在妊娠和分娩中发生最凶险的并发症之一。虽然近代急救技术发展迅速，但是AFE产妇的病死率仍在60~80%之间。2002年监测资料表明，我国孕产妇死于羊水栓塞者占9.5%，占孕产妇死亡顺位的第三位。1996~2005年我国监测资料显示AFE是导致母亲死亡的死因顺序的第三位。AFE是一种不可预料的极其凶险的且治疗效果不好的产科并发症。至今，虽仍然没有对AFE进行确切的定义、描述和解释。羊水内容物进入母体血循环以后，可能激活补体，补体被激活后导致粒细胞的损伤，从而释放蛋白酶类的凝血活性物质，促进血液凝固。羊水栓塞时孕鼠血清胰蛋白酶的变化国内外报道少见。本研究主要通过孕鼠羊水成分注射，观察羊水成分对孕鼠血清胰蛋白酶的动态变化，探讨胰蛋白酶在羊水栓塞中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物 选取第三军医大学大坪医院实验动物中心提供的SPF级健康成年SD（Sprague-Dawley）雌性大鼠15只。取孕期第21天SD大鼠进行试验，达到体重460~550 g，健康状况良好。将15只健康妊娠晚期 SD大鼠随机平均分为3组：①尾静脉注射生理盐水组5只（正常对照组），②尾静脉羊水成份注射后1h取血组5只（羊水注射1h组），③尾静脉羊水成分注射后2h取血组5只（羊水注射2h组）。

1.2 实验方法

1.2.1 羊水的收集方法和实验动物处理 ①在大鼠受孕21天，以0.04g/100 g腹腔注入4%利多卡因麻醉；②大鼠仰卧固定、备皮、消毒、切开皮肤后，用注射器抽取羊膜腔内羊水；③抽出的羊水以4000G/min离心1min后，取上清液；④羊水上清液以0.5 mL/100 g的剂量从鼠尾静脉注入羊水注射1h组和羊水注射2h组的孕鼠体内。正常对照组注射同样容积的生理盐水，注射方式均相同；⑤分别在注射完毕1h和2h后，处死大鼠前从右心室使用真空采血管采集静脉血，每管1.8 mL静脉血与枸橼酸钠混匀(109mmol/L枸橼酸钠溶液1：9抗凝)，后立即对所取血液标本采用4000r/min离心5min，在分离血清用ELISA法检测血清类胰蛋白酶。

1.2.2 ELISA法检测血清类胰蛋白酶 ①建立标准曲线、设置标准孔；②加样：分别设空白孔、标准孔和待测样本孔，空白孔不加样品和酶标试剂，加样孔中每孔各加入已融化的上清液50L；③温育：反应板置37℃反应30 min；④洗涤：洗板用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向滤纸上印干；⑤加酶：每孔中加入酶标试剂50L，空白孔除外；⑥温育：反应板置37℃反应30 min；⑦洗涤：洗板用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向滤纸上印干；⑧显色：每孔加入显色剂A50L，再加入显色剂B50L，反应板置37℃反应15min；⑨终止：每孔加终止液50L，此时蓝色转为黄色；⑩测定：以空白孔调零，450nm波长测定各孔数值。应在加入终止液后15 min内进行。

2 结果

羊水注射后1h和羊水注射后2h两实验组血清类胰蛋白酶均高于生理盐水组，且具有统计学意义（＜ 0.05）（表 1）。

3 讨论

类胰蛋白酶是一种中性丝氨酸蛋白酶,其分子质量为134ku，是储存在肥大细胞颗粒中最丰富的一种介质，几乎只由组织肥大细胞释放[2]。肥大细胞类胰蛋白酶的释放是肥大细胞激活的可靠标志，而且是临床评价过敏性疾病的有用指标[3]。尽管环境、样本采取和储存的方法等有所不同，但类胰蛋白酶在死亡早期阶段的降解不明显，在死后诊断过敏反应中的价值已被大家认可[4,5]。

类胰蛋白酶在肥大细胞脱颗粒后短时间内在血清或血浆中就可测出。 类胰蛋白酶在血液中的半衰期较长，约为2h，肥大细胞脱颗粒后数小时仍能进行 类胰蛋白酶的检测。而且 类胰蛋白酶相当稳定，它可存在于体内几天，死后一定时间内血中仍可检测到 类胰蛋白酶

[6]。

近年来有学者发现,冠心病、创伤性死亡、婴幼儿猝死综合征、注射海洛因死亡尸体血中类胰蛋白酶也有中等度的升高，尤其是一些心肌梗死、创伤性死亡者血中类胰蛋白酶很高，因此认为类胰蛋白酶的测定对证实过敏性死亡是有价值的，但不能单独依据类胰蛋白酶的测定来进行诊断[5]。

肥大细胞参与人类速发型过敏反应的启动，且参与过敏反应全过程。正常机体只有少量类胰蛋白酶分泌至血液，当发生过敏性休克或羊水栓塞时，由于肥大细胞脱颗粒则导致大量类胰蛋白酶入血液，使患者血清中的浓度显著增高。发生羊水栓塞时，应用免疫组化方法检测肺循环中肥大细胞类胰蛋白酶，可以发现大量的阳性颗粒细胞；而应用ELISA法测量血清中类胰蛋白酶浓度，可发现实验组的浓度显著高于对照组。

本实验发现当给孕鼠尾静脉注射羊水成分后，孕鼠血清中的类胰蛋白酶增高，反映了肥大细胞被激活，肥大细胞脱颗粒，释放类胰蛋白酶等炎症介质，导致过敏反应等一系列病理生化反应的过程。

[1]Arnone B.The amniotic fluid embolism:a case report[J].Jnurese midewifery，1999，34:92-94.

[2]龚非力.医学免疫学[M].北京:科学出版社,2004.34-41.

[3]Kevin D，John F，Ross E.Utilization of Serum Tryptaseand Immunoglobulin E Assay in the Postmortem Diagnosis of Anaphylaxis[J].The American Journal ofForensic Medicine and Pathology,2004,25(1):37-43.

[4]Nishio H，Suzuki K.Three case of suspected hyperthermia with remarkable elevation of serum mast celltryptase[J].Forensic Sci Int,2005，149(1):51-55.

[5]Edston E，Van HM.Beta-tryptase measurements post-mortem in anaphylactic death and in controls [J].Forensic Sci Int,1998，93(2-3):135-141.

[6]Yunginger JW，Nelson DR，Squillace DL，et al.Labortory investigation of deaths due to anaphylaxis[J].JForensic Sci,1991,36(3):857-865.