免疫分析方法在毒品检测中的应用与进展

李 阳，孙杰燕

（中国刑事警察学院法化学系，辽宁 沈阳 110035）

免疫分析方法在毒品检测中的应用与进展

李 阳，孙杰燕

（中国刑事警察学院法化学系，辽宁 沈阳 110035）

文章综述了免疫分析方法在毒品检测中的应用及其发展，并分别对放射免疫法、酶标免疫分析法、荧光偏振免疫分析法、免疫胶体金技术在毒品检测中的应用进行了论述。

毒品检测；免疫分析方法

毒品问题已成为全世界面临的重大社会问题之一，常见的毒品包括安非他明、甲基安非他明、吗啡、盐海洛因、蒂芭因、那可汀、罂粟碱和可待因。有关于毒品检测的问题迫切需要解决。在毒品分析的过程中，相应分析检测技术得到了极大的发展，各种检测技术的应用为吸毒者的认定、戒毒治疗过程的监测以及以后的监督提供了严格的科学依据。而国内外陆续报道关于毒品的多种检测方法，多是需要依赖一些价格昂贵的检测仪，这就限制了毒品犯罪案件的现场快速检验。而免疫学检测方法恰能在这方面实现对毒品的检测。本文对免疫分析方法在毒品检测中的应用与进展做一简要综述。

1 免疫分析技术在毒品检测中的发展

免疫分析技术按其在毒品分析中的应用和发展历经了3个阶段。酶联免疫吸附法是第一代免疫检测方法。它采用聚苯乙烯微孔板作为包被抗原或抗体的介质。检测时步骤冗长，试剂繁多（包括抗原母液、稀释液、洗涤母液、底物液、显色液等），洗涤时微孔板须经反复甩打方可除去孔内液体，且操作不方便，容易污染周围环境且实验的重复性较差。第二代是免疫诊断技术（渗滤法），出现于20世纪80年代末，它以斑点免疫印渍为原理，用印渍纸代替96孔聚苯乙烯微孔板固定抗原或抗体，用叠放于印渍纸下打的吸水纸吸引洗涤液。其法灵敏度和特异性与酶联免疫法相似，但抗体用量少，且操作较简便、快速。但由于免疫诊断的试剂仍存在着需附加几种试剂的不足，所以在20世纪90年代又出现了将免疫亲和技术、印渍术和薄层层析技术结合运用，用胶体金法研制的一种更加简便的免疫层析诊断试纸条。使用时，只需把试纸条下端直接插入样本溶液中，2～5 min即可判断结果。此法是目前检测毒品的最先进的免疫学方法，具有灵敏、特异、简便、快速、试剂稳定等优点，在毒品检测中有着广泛的应用前景。但其缺点是检测时待测样品的浓度、检测时的温度等条件将决定胶体金试纸条的灵敏度，仍需进一步完善。

2 用于毒品检测的主要免疫分析技术

免疫测定法不需要复杂的样品前处理程序，简单、快速，可方便的进行筛选和现场分析，其中包括放射免疫分析（RIA）、酶联免疫分析（ELISA）、荧光免疫分析（FIA）、金标免疫分析等。可供选用的商品化检测产品也很多。检测的对象也由原来的尿液扩展到唾液、汗液和毛发。如用放射免疫分析检测海洛因滥用者唾液中的吗啡；采用EIA检测汗液中的海洛因、吗啡、6－单乙酰吗啡和可待因，检测唾液中的大麻和鸦片；用酶联免疫分析方法分析汗液中的吗啡、可待因等鸦片类毒品；用放射免疫分析法定量分析毛发中的6－单乙酰吗啡，当浓度大于0.5 ng/mg时，分析结果与GC/MS分析的一致性较好。其具体应用情况如下：

2.1 放射免疫分析（RIA）

放射性免疫法是利用放射性同位素对滥用者的唾液和血液进行检测。其商品试剂盒对于血液中吗啡的检出限可以为0.3 ng/mL，这种方法不但准确性好，而且重现性也高，回收率100 %。且海洛因用量增大，吸毒时间越长，唾液中吗啡的含量越高，因此放射性免疫法还可以用于海洛因和吗啡的依赖性诊断。放射性免疫法还可以用来测定毛发中的吗啡或可卡因的含量。其可靠性已经被气相色谱－质谱方法所证实。1979年，Baumgartner等人用放射性免疫法成功的测试了吸毒者毛发中的海洛因及其代谢产物，并由此对吸毒者进行了用药时段的推断。放射性免疫法分析的灵敏度高，可以直接获得吗啡总量，且测定总量可达到 1～60 ng/mL。采用放射免疫分析法检测尿中吗啡浓度，具有特异性强、灵敏度高、所需仪器设备简易、试剂较便宜、检测时间较短等优点。通常在收到尿样后2 h内就可得出结果，一般实验室均可开展检测。

2.2 酶免疫分析（EIA）

酶免疫分析是为了克服放射性同位素所引起的危害而发明的一种使用具有催化活性的生物酶作为免疫反应标志的一种技术。主要有两种常用的酶免疫分析法。

2.2.1 酶联放大的免疫测试技术（EMIT）

此技术是使用溶菌酶作为连接到所研究药物上标记物的一种免疫分析方法，这种酶能催化某些细菌细胞壁膜多糖成分的水解作用。当抗体与酶上所连接的药物作用时，酶就变得没有活性了，如果样品中有药物存在，酶就会被释放出来，发生水解作用，并进行检测，其活性就是药物浓度。此技术可以用来测定吗啡、海洛因、可卡因等多种毒品。商品试剂测定可卡因可以达到0.24 ng/mL。简便快捷的酶联放大免疫测试方法成为现场快速定性检验的研究方向。

2.2.2 酶联免疫吸附测试技术（ELISA）

酶联免疫是目前最流行的一种通用酶标记抗体试剂的非均相的免疫分析技术。早期的酶联免疫沿用了放射性免疫法的有限量标记抗原或半抗原与样品分析物共同竞争特异性抗体的概念，现发展到多种夹心的方法。此方法可以快速、定性检测血清或尿中的吗啡，而且具有明确可读的优点。也有有关ELISA用于大麻和可卡因的报道，但这种分析方法灵敏度相对较低。

2.3 荧光偏振免疫分析（FPIA）

荧光偏振免疫分析是使用荧光基团代替放射性同位素作为标记物的分析方法。目前在毒品分析中使用最多的是荧光偏振免疫分析。此技术制成试剂盒，广泛用于大麻和可卡因的检测。如利用荧光免疫分析方法的商品试剂盒，海洛因的检测血浓度是 345.02±132.60 ng/mL，苯妥英钠的检测血浓度是 20.26±17.2 ug/mL。Kraemer等测定了尿液中的安非他命及其代谢物的含量，安非他命的检出限为50 ug/L，测定结果与GC－MS方法基本一致。Williams等测定了血液和尿液中的可卡因及其代谢物的含量，方法简单、快速。Tsatsakis等测定了头发样品中的二苯基海因，并与HPLC方法作了对照，两种方法的分析结果非常接近（R＝0.987）。荧光偏振免疫分析方法具有重复性好，灵敏度和特异性接近色谱分析水平，可实现快速全自动化等特点，是检测毒品血浓度的一种快速可靠的免疫分析方法。

2.4 免疫胶体金技术（ICT）

胶体金是氯金酸在还原剂的作用下，可以聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态。利用胶体金标记的单克隆抗体与免疫层析技术相结合生产的以试纸条的形式存在的试剂盒已经应用，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维膜的某一区域，当该干燥的硝酸纤维膜一端浸入样品溶液后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动到有相应抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。曾立波等人研制的氯胺酮胶体金单克隆抗体免疫层析检测板经过大量实验，结果表明适用于包括水和多种饮料的不同样品条件下氯胺酮毒品的现场快速检测，通过肉眼观察检测区的条带来确定阳性或阴性，简单便捷地进行定性分析，最低检测极限可以达到50 ng/mL。除此之外，还有胶体金标记苯丙胺单克隆抗体免疫试剂盒，胶体金标记检测大麻单克隆抗体免疫试剂盒，可卡因及其代谢产物苯甲酰爱康宁胶体金检测试剂盒。此法具有非常高的灵敏度、特异性很强、简便、快速、试剂稳定等优点，在一些常见毒品的检测中已广泛应用。但胶体金技术的缺点是难以进行质量控制，即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性，因此一般只能用于定性试验，不能进行定量分析。

3 分析用样品的选择

毒品检测中的样品主要有尿样、血样（全血、血清或血浆）、汗液、唾液及毛发等。各样品中的药物浓度因毒品使用的方式、时间、剂量及药物在体内的代谢方式不同而不同，检测时应视具体情况而定。譬如血液的检测窗口期最短，一般只有数分钟或几小时，尿样的检测窗口期有2～3 d，通过特殊收集装置收集的汗液检测窗口期为数星期，毛发和指甲的检测窗口期最长，一般为数月或数年。对大多数药物而言，尿样或血样中的药物母体浓度较低，主要是代谢物，如服用吗啡后仅有 2%～12%无变化的吗啡自尿中排出，而60%～80%排出的是结合的代谢物（葡萄糖醛酸结合物），汗液中的主要分析物是药物母体，如在服用甲基苯丙胺后，汗液中主要为甲基苯丙胺，只有少部分的苯丙胺。在服用海洛因或可待因后汗液中的主要成分是海洛因、6－单乙酰吗啡或可待因。毛发中的药物形式则主要受药物整合方式的影响，虽然理论上毛发是最佳的检测样品，具有上述的诸多优点，但现在最常用的样品是尿样，这主要是因为尿样收集方便且能反映滥用者当时的情况，最符合现场实际工作的需要。

4 免疫分析方法的选择

理论上各种免疫分析方法都可用于毒品检测，具体应根据实验室情况而定。临床上对免疫反应的评价要求免疫反应与生物样品中的分析物有交叉、在药物浓度范围内有动力学曲线，且可准确地检测药物的存在。现国际上通常用通过气相色谱－质谱联用（GC－MS）得到的接受器操作特征（ROC）曲线来选择检测阈值标准以使诊断的灵敏度、特异性和预测值最优化。如国际上规定可卡因常规的初筛和确认实验（GC－MS）的阈值是300 ug/L和150 ug/L，大麻是50 ug/L和10 ug/L。分析用样品主要是尿样。现在商品化试纸的灵敏度已基本上达到其他各种检测方法的灵敏度，而且是单一试剂，一步操作，干燥保存的试剂可在室温保存1 d以上就可以。缺点是难以进行质量控制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性，因此一般只能用于定性试验。在临床研究中，对各种免疫分析方法的评价都以确认实验（如GC－MS、高压液相色谱法HPLC、薄层色谱法TLC或气相色谱法GLC等）做对照。

Mule等人曾报道用放射性免疫法（检测灵敏度100 ug/L）、TLC（检测灵敏度1～2 mg/L）、GLC（检测灵敏度50 ug/L）、EMIT（检测灵敏度1 mg/L）。同时检测200例尿样中的苯甲酰牙子碱，结果显示放射性免疫法与GLC的符合率是95.9%，与TLC的符合率是87.0%，与EMIT的符合率是84.5%，Armbruster认为EMIT的方法在检测巴比妥类中优于放射性免疫法，在检测大麻、可卡因和阿片类时比放射性免疫法差。

5 毒品免疫检测试剂的发展趋势

现阶段免疫检测法的局限是单抗及其稳定性和生化试剂不能在常温贮藏下长期保持生物活性问题。因此，单抗的相应性质的研究和生化试剂的“可逆性固化技术”及利用物质在温度低于或等于“玻璃态转换温度”时会形成并保持玻璃形态的原理，将酶标抗体、蛋白质、核酸等活性物质制成“玻璃化”产品的研究，将是毒品免疫检测方法新的研究方向。同时，我们可以预测在未来的免疫分析法中：化学发光免疫分析、生物发光免疫分析、免疫—场效应管传感器、光纤—免疫传感器、生物—化学发光免疫传感器，将随着科技的发展逐渐运用到毒品的检测中。

6 结束语

总之，免疫技术是一类高特异和灵敏度很好的分析方法。在药物滥用的检测、监测，药物在人体中的代谢途径和代谢水平及其对人体免疫功能的损伤等方面的检验中都起着极为重要的作用。特别是免疫分析法的应用，使快速检验、现场筛选、多种毒品一次性、快速检测已成为可能。而这正是公安机关侦察破案所需要的，有着不可估量的应用前景。

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8 彭亦如、林昌铨.免疫分析法在毒品检测中的应用［J］.引进与咨询，2003（3）：39～41

Immunity Analysis Method in Narcotic Examination Application and Progress

Li Yang，Sun Jieyan

The article summarized the immunity analysis method in the narcotic examination application and the development, and to emitted the immunization, the enzyme sign to exempt separately the epidemic disease analytic method, the fluorescence polarization immunity analytic method, the immunity colloid gold technology to carry on the elaboration in the narcotic examination application.

narcotic examination; immunity analysis method

D919.2

A

1000－8136（2011）06－0006－02