邓紫玉 孙鹥 林俊 万颖 屈晓雯 赵芳
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是中老年人最常见的骨关节疾病,其最早出现的改变是关节软骨的损伤。软骨破坏的病理表现是软骨外基质(extracellular matrix,ECM)的降解,而聚蛋白多糖的丢失是这一过程的主要病理表现之一[1]。正常、退行性变的关节软骨在代谢转化过程中释放的代谢产物进入血液和关节液中,聚蛋白多糖酶(ADAMTSs)就是这样一种相对特异的软骨代谢标志物。本研究通过检测血液和关节液中的ADAMTSs,以探讨其与OA的相关关系及在OA早期诊断中的意义。
1.1 一般资料 为2008年11月至2011年3月云南省第一人民医院住院及门诊膝骨关节炎患者。其中男36例,女51例,23~81岁,平均45.8岁,均符合美国风湿病学分会1987的骨关节炎诊断标准。30例健康体检者为正常对照组。
1.2 排除标准[2]①有炎症、创伤及手术史,肿瘤、糖尿病等疾病的患者。②诊断或疑似为类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的患者。③检查前两周内使用过糖皮质激素、非甾体抗炎药的患者。④妊娠、哺乳期间的妇女。⑤有感染性关节炎、其他反应性关节炎等关节疾病的患者。
1.3 主要试剂 采用德国的Invitek GmbH公司提供的聚蛋白多糖酶活性测定试剂盒。
1.4 实验方法 抽取患者关节液和血清,冻存于-70℃。样品在检测前恢复至室温,严格按照说明书进行操作。样本首先用底物孵育。底物被水解15 min,反应成2个多肽片段,伴有N基末端ARGSVIL多肽通过双抗体夹心酶联反应定量测定。首先在酶标板预包被抗新表位ARGSVIL抗体,加入蛋白水解反应混合物孵育,然后加入抗聚蛋白多糖二抗,最后加入辣根过氧化酶后无色的显色剂转变成黄色,在450 nm 处检测光密度值,通过标准曲线算出样品中聚蛋白多糖聚合酶活性。
1.5 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件对所得数据进行处理。所得数据以表示,用分析OA及对照组中各指标OD值之间的差异,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 不同组别关节液ADAMTS-4的浓度 见图1。早期OA患者关节液中的ADAMTS-4浓度为(53.05±16.11)pM,中晚期OA患者关节液中的ADAMTS-4浓度为(28.34±10.87)pM,两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。
图1 ADAMTS-4在关节液中的表达
2.2 不同组别血清中ADAMTS-4的浓度 见图2。早期OA患者血清中的ADAMTS-4浓度为(31.23±18.34)pM,中晚期OA患者血清中的ADAMTS-4浓度为(20.11±9.22)pM,正常对照血清中大部分标本无法检测出ADAMTS-4浓度,在计算时按<10pM进行统计。结果表明,早期和中晚期OA组均高于正常对照,差异具有统计学意义(P<0.05);两组相比,差异也有统计学意义(P<0.05)。
图2 ADAMTS-4在血清中的表达
OA是中老年人最常见的关节退行性疾病,困扰着全世界约2亿多患者。根据流行病学调查,55~64岁的人群中发病率达40%,随着世界老龄化人群的增加,OA的发病率也呈现逐年上升趋势[3]。中国OA患者人数估计将超过1亿,OA导致的痛苦和残疾严重损害患者的生活质量并成为社会的一个经济负担之一。当前对于OA病程中作用于蛋白聚糖的各种蛋白水解酶的探索方兴未艾,其中ADAMTS-4和ADAMTS-5在OA中的发病机制研究已成为热点[4-8]。
引起软骨降解的原因很多,该过程中最主要的原因是蛋白水解酶活性增高。聚蛋白多糖酶是一种蛋白水解酶,是指能在核心蛋白球间区(IGD)Glu373-Ala374位点降解聚蛋白多糖的蛋白酶,被广泛认可的有ADAMTS-4和ADAMTS-5。
关节液及血清学检查用于OA的早期诊断一直在探索中,近年陆续报道了一些与软骨代谢有关的生物标志物,它们包括一些软骨成分、细胞素、蛋白酶等。聚蛋白多糖酶是与OA关系密切的酶,Naito等[9]通过对正常软骨和OA软骨的研究认为,ADAMTS-4在人OA的聚蛋白多糖的降解中起主要作用,而ADAMTS-5呈结构性表达。OA关节中也有ADAMTS-4和ADAMTS-5的基因表达。而且ADAMTS-4 mRNA在OA软骨中的表达明显上调[10]。以上结论与本研究一致。本研究通过检测关节液及血清中聚蛋白多糖酶的表达,发现了聚蛋白多糖酶参与了软骨聚蛋白多糖酶的分解代谢,ADAMTS-4和ADAMTS-5是在OA病理机制中最可能起作用的酶。因为ADAMTS-4在OA早期和中晚期关节液和血清中明显增多,尤其是ADAMTS-4在OA血清中的表达明显上调,说明ADAMTS-4有早期诊断意义。当然,ADAMTS-4在中晚期OA软骨降解中同样有重要作用。对该酶的抑制不仅有可能防止OA的发生,而且有可能控制OA的进展。
结合本实验结果与已有的文献报道,我们认为ADAMTSs在OA病变过程中起了重要作用。ADAMTSs的特异性有待于进一步证实,临床应用ADAMTSs作为辅助早期诊断OA时,须紧密结合临床特点。ADAMTSs的发现为预防和治疗OA提供了一定途径。
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