大蒜提取液对铜绿假单胞菌LAS基因转录水平影响的研究

梁群，孙晖，蒋希成

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

密度感知系统(QS)是一种细胞与细胞间信号传递机制，其应答反应的产生依赖细胞的阈值浓度，信号因子AHLS亦产生增多，被自身感知，便可激活QS系统，形成LasR－AHLS和RhlR－AHLS复合物，增强下游一系列毒性基因。LasR基因起关键与决定性作用［1］。本研究拟通过在铜绿假单胞菌培养的阶段加入大蒜液，应用PT－PCR技术观察其在转录水平对铜绿假单胞菌QS系统影响。

1 试剂与仪器

MMN反转录酶、总RNA提取试剂盒(TRIZOL Regent，Invitrogen公司);反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、ThermoScript RT－PCR System(Invitrogen公司);Tris碱、EDTA、溴化乙啶(Sigma公司);引物(上海生工公司);DNA标准分子量MarKer(DL2000，上海申能博采公司);DEPC(Amersco公司);铜绿假单胞菌野生菌株PAO1、铜绿假单胞菌Las及Rhl基因缺失PAOJP2(丹麦哥本哈根大学临床微生物研究所吴红博士提供);铜绿假单胞菌质控菌ATCC27853;Muller－Hinton肉汤(MHB，美国 DIFCO公司);胰酶大豆肉汤(TSB，法国 bioMerieux公司);Muller－Hinton肉汤(MHA，美国DIFCO公司);比浊仪(法国bioMerieux公司);PCR扩增仪(2720型，ABI公司);超声振荡清洗机(北京医疗仪器厂);凝胶成像系统(Bio－Vision++，法国VILBERLOURMAT公司);PCR电泳槽(小型水平电泳槽，BioRad公司);RT－PCR实验中所有的玻璃器皿均经由0.1%DEPC水处理，放置在37℃的环境下2h，再用双蒸水冲洗，然后经过高压灭菌的方式，在220℃的环境下烘烤4h。

2 方法

2.1 药物制备

大蒜提取液:新鲜大蒜剥皮，取100g，用高锰酸钾(1∶1000)溶液浸泡30min，以无菌蒸馏水洗涤2次，置于无菌的研钵内捣成糊状，按1∶1加无菌蒸馏水，混合后离心沉淀，取上清液(浓度为每毫升含生药1g)存放备用。

2.2 分组

PAO1和PAO－JP2两株菌。大蒜三个浓度组(40ug/ml、80ug/ml、100ug/ml)以及空白对照组，共计5组。

2.3 菌株的培养

1)挑取新鲜培养的铜绿假单胞菌PAO－JP2及PAO1单个菌落，放置于20ml的TSB肉汤中，以170r/min的频率摇匀，时间为4～5h，将比浊仪的浓度调至0.5McFarland以便于备用。

2)分别吸取10ml的培养液置于无菌培养管中，依次调节大蒜液的浓度，使得最终浓度分别为40ug/ml、80ug/ml、100ug/ml，应用震荡培养的方法达 2 ～3h。

3)将震荡后的培养液吸取入无菌离心管，高速离心10min，弃去上清液，并且将收集到的细菌标本重新悬浮于1ml MH肉汤内，4 000rpm离心10min，弃上清液备用。

2.4 细胞总RNA的提取(TRizol法)

1)在每个培养瓶中加入0.25%的胰蛋白酶1ml，消化时间为2min，继续加入含10%FBS的MEM培养液2ml用于终止消化，然后将细胞附着面用弯头吸管吹打，并将吸取细胞悬液到一个15ml的新离心管里，在室温下，以8 000rpm的频率离心5min。

2)加入1ml TRIZOL试剂到每个离心管中，将细胞用枪头反复吹打，用5min的时间进行室温下孵育，将其吸入到1.5ml的新eppendorf管中，将0.2ml氯仿(三氯甲烷)加入每个管中，上下混匀翻倒15sec，然后在室温条件下放置达3min的时间，在4℃，12 000×g的条件下离心15min。

3)将上清液吸入另一新的 eppendorf管中，将0.5ml异丙醇加入每个试管内，在室温条件下放置达10min，然后在4℃，12 000×g的条件下，离心10min;弃上清液，加入1ml75%的乙醇，然后4℃，7 500×g离心5min;弃去上清液，待沉淀干燥后，在每个试管内加入30ul的DEPC－H2O以溶解沉淀。RNA的含量采用紫外分光光度计来测定。

2.5 反转录PCR反应

1)模板变性:5ul总 RNA、1ul Oligo(dT)20、2ul 10mM 的 dNTP Mix、4ul DEPC － Treated Water，65℃ 加热5min用来溶化模板二级结构，然后立即冷却于冰上。

2)反转录:直接加入5×cDNASynthesis Buffer 4ul、0.1M DTT 1ul、8ul总 cDNA、RNaseOUTTM(40u/ul)1ul、DEPC － TreatedWater1ul、ThermoScriptTMRT(15U/ul)1ul、合成cDNA、混合液在55℃的条件下反应60min，在85℃的条件下反应5min。

3)然后每支管加入1ul的RnaseH，在37℃的条件下放置20min;放入4℃冰箱作为暂时保存之用，若要长久保存，则应当放入－70℃冰箱内。

4)PCR 扩增:Platinum Taq High Fidelity 0.5ul、50mM MgCl215ul、10uM antisense prime 1ul、10uM sense Primer 1ul、cDNA 合成 3ul、10 × HighFidelityPCRBuffer(无镁)5ul、DEPC －TreatedWater37ul共计50ul。

5)PCR必需反应条件:94℃5min;94℃30sec;60℃42sec;72℃42sec;72℃10min延伸;扩增40个循环，4℃保存。

图1 大蒜对铜绿假单胞菌LasR基因RT－PCR分析结果

3 结果

结果如图1，左边泳道为MarKer，由左及右依次为PAO－JP2阴性空白对照组、PAO－1阳性空白对照组、大蒜液剂量组 40ug/ml、80ug/ml、100ug/ml，1 为 β－actin，大小为560bp，2为反义mRNA大小为210bp。PAO－1阳性空白对照组可有效表达LasR基因，但明显的剂量－效应关系则随着不同浓度的大蒜液加入培养基后被逐步表达了出来。同时，反义mRNA的表达量随着亚抑菌浓度的增高也在逐步地减少，PAO－JP2阴性空白对照组由于缺失QS系统不能有效表达LasR基因。出现这种结果可能系大蒜抑制了QS系统的表达进而影响到其转录水平的表达，可能大蒜生物活性成分结构是否与AHL相类似的对调节器的转录子LuxR和LasR的竞争性抑制，有待一步研究。

4 讨论

铜绿假单胞菌是一种机会致病菌，可以导致很多种感染。QS系统是指细菌通过感知其群体的细胞密度，从而调控特定的基因活化与表达，并且通过感知周围同伴的存在，达到一定的密度，从而表现出一定的行为。两个联级的QS系统包含在铜绿假单胞菌中，一组是控制某些二级代谢产物的RhIR－RhlI系统的主要基因，另一组是控制细胞外毒力因子表达的LasRLasI系统，在铜绿假单胞菌密度感知系统发挥作用的情况下，以及实现正反馈作用的过程当中，LasR－LasI基因起关键作用。本实验在不改变培养基的组份、氧浓度的情况下，研究大蒜液对LasR基因转录的影响。根据实验结果发现，PAO－1阳性空白对照组可有效地表达出LasR基因，但随着培养基中加入不同浓度的亚抑菌浓度的大蒜液后，剂量－效应关系则被明显地表达了出来，即随着大蒜液亚抑菌浓度的增高，反义mRNA的表达量也在相应地减少过程中。PAO－JP2阴性空白对照组由于缺失QS系统而不能有效表达LasR基因。这可能系大蒜液抑制了LasR基因的表达，进而抑制了QS系统。AHLS是QS系统的产物，国外有报道发现大蒜液能降低AHLS的产生，本次实验的结果能够说明其部分原因。这一实验结果与国外相关的报道结果一致［2－4］。另外，我们已知 QS系统可调控铜绿假单胞菌的致病因子外毒素A和弹性蛋白酶的产生，此实验结果也进一步说明了致病因子的产生是在基因水平上受到了大蒜液提取物的影响。

［1］Dong，YH，Gusti.Identification of quorum － quenching N － acylhomoserine Lactonnases from Bacillus species［J］.Appl Envion Microbiol，2002，68:1754 －1759.

［2］Catalina，AF.Hentzer M，Riedel K.Identifcation of quorum － sensing regulated proteins in the opportunisitic pathogen Pseudomonas aeruginosa by proteomics［J］.Envriomental Microbiology，2003，5(12):1350－1369.

［3］Kurreck J.Antisense technologies:Improvement through novel chemical modifications［J］.Eur J Biochem，2003，270:1628 －1644.

［4］Nouwens.Garlic blocks quorum sensing and promotes rapid clearing of pulmonary Pseudomonas aeruginose infections［J］.Microbiology，2005，6(11):1100－1117.