盐酸川芎嗪促进异种脱细胞真皮修复大鼠皮肤缺损的动物实验研究

苗波，刘宇，刘杰，唐海波，徐雷，文晶

(1.佳木斯大学附属口腔医院，黑龙江 佳木斯 154002;2.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

颌面部的皮肤缺损的修复是口腔颌面外科临床常见的问题之一，对创面覆盖物的研究表明，如果缺乏真皮成分的支持和调控，来自创面的基底的成纤维细胞将合成不成熟的基质，最终成为瘢痕而取代缺乏的真皮，造成创面愈合后质量较差［1－2］。异种真皮修复粘膜缺损已在临床上广泛应用，但是很少将其用在皮肤缺损的修复上，主要原因在于皮肤缺损修复后很难早期建立血供，因而皮片不易成活，而川芎嗪治疗大鼠缺血皮瓣及促进局部组织微循环均已得到证实［3－4］。本研究旨在观察盐酸川芎嗪注射液用于猪脱细胞真皮基质支架(porcine acellular dermal matrix，PADM)材料修复大鼠皮肤缺损后的效果和反应，探讨此种药物对PADM修复大鼠皮肤缺损的影响，为临床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂

猪脱细胞真皮PADM(第四军医大学提供);36只SD大鼠，体质量在150～200g之间(佳木斯大学动物中心提供);盐酸川芎嗪注射液;TRIZOL试剂盒(大连宝生物有限公司);RNA PCR KIT(AWV)VER.3.0试剂盒(大连宝生物有限公司)。

1.2 实验分组

36只SD大鼠，随机分为3组，实验组采用PADM+自体刃厚皮片移植，并每日腹腔注射(150mg/kg)盐酸川芎嗪注射液5ml(6周)［5］;对照组采用PADM+自体刃厚皮片移植组，并每日腹腔注射5ml生理盐水;空白组采用单纯自体刃厚皮片移植，并每日腹腔注射5ml生理盐水。

1.3 手术及处死

实验组及对照组是将大鼠用水合氯醛腹腔麻醉后，电推备皮，3%稀碘伏消毒大鼠背部3次，铺无菌巾，在背部取下2cm×3cm全厚皮，用鼓式取皮机将全厚皮制备成自体刃厚皮片，厚度为0.2～0.3mm，将自体刃厚皮片覆盖于PADM上，并同期植入创面，荷包缝合，碘仿油纱加压固定，2周后拆线。此后在14天，21天，30天，45天每组分别随机抽取3只SD大鼠处死，并大体观察植皮区创面愈合情况及弹性等。

1.4 标本的制取及大体观察

大鼠处死后，取下置入的材料和组织，一半组织放入液氮中冻存，另一半放入多聚甲醛中固定，并标明组别及周期;大体观察大鼠皮肤缺损修复后愈合情况及移植真皮血管化情况。

1.5 HE、VG 染色观察

组织标本制取:1)取材:实验组与对照组取标本大小为2.0cm×0.5cm，厚度约为0.5mm。2)固定:多聚甲醛固定。3)脱水(在脱水机中进行):从30%乙醇开始，经过50%、70%、80%、95%、100%至完全脱水。4)包埋:表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。5)切片:观察各组实验标本中各层细胞及血管长入材料的情况，及胶原纤维的分布及排列情况等(HE染色:细胞浆为红色，细胞核为蓝紫色;VG染色:胶原纤维呈红色、肌肉、神经胶质、胞浆、血管呈黄色，细胞核呈黑蓝色或棕蓝色)。

1.6 RT－PCR定量检测液氮保存的各组标本中表皮生长因子(EGF)含量

引物的设计:表皮生长因子(EGF)的上游引物为5'－GTCTCGACGTTGATGAGTGCC－'3，下游引物为5'－CCGTCTTGACTTCGGTTTCTG－'3;β－actin的上游引物为5'－GGATGCCACAGGATTCCATACCC－'3，下游引物为5'－GTGTTGGCCCTGTATGCCTCTGG－'3。

样本总RNA的提取及PCR产物的制备:TRIZOL法分别提取12组标本的总RNA，紫外分光光度仪检测RNA质量和浓度;步骤按试剂盒说明书进行，所得cDNA置－20℃保存。EGF引物分子量为1 152bp，β－actin分子量为406bp，RT反应体系为10μl。采用浓度1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳产物经EP荧光染色后紫外灯下观察结果，采用DH－2000 DigitalImaging Systems仪分析图像。

1.7 统计学处理

采用SPSS 18.0软件作统计分析，定量RT－PCR的数据结果用t检验进行组间差异显著性统计学分析，以(s)表示，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 动物实验标本大体观察

术后4周，实验组(盐酸川芎嗪腹腔注射)植皮区愈合良好，取材时肉眼观察到实验组大鼠PADM血管化程度明显高于对照组，且皮肤触之弹性较好，而对照组皮肤弹性一般;空白组植皮区基本愈合且成活率较高，但皮片因缺乏真皮层，触之较硬，最终形成瘢痕样组织。在创口愈合时间及皮片成活方面实验组优于对照组。

2.2 HE、VG 染色观察

HE染色结果显示，实验组中细胞较多的移入移植材料PADM中，胞核浓染，可见基底细胞排列整齐，上皮细胞排列完整，真皮层(PADM)血管丰富，无炎性细胞浸润;对照组中可见上皮钉突伸长，上皮细胞排列基本完整，角化层明显，亦可见细胞移入真皮层(PADM)中，并有少量血管存在;空白组中可见大量毛囊等皮肤附件，胞核浓染，无皮肤真皮层，上皮过角化并可见荚膜存在。

VG染色结果显示，实验组可见胶原排列呈卷曲状且整齐、规则，较为接近大鼠自体皮肤，真皮层(PADM)间存在较密集黄染的毛细血管;对照组胶原排列较为整齐，但真皮层(PADM)间血管化不明显;空白组胶原纤维排列紊乱无规则，与瘢痕的胶原排列情况较为接近。

2.3 RT－PCR结果 结果见图1，图2，表1。

图1 各组EGF mRNA及β－actin光密度值的曲线分析

盐酸川芎嗪腹腔注射组EGF mRNA的表达明显高于对照组和空白对照组，经统计学分析(见表1)，盐酸川芎嗪腹腔注射组EGF条带光密度/β－actin条带光密度的值与对照组和空白组相比，有差异(P＜0.05);对照组与空白组比较，无差异(P＞0.05)。

表1 EGF mRNA在各组中的相对表达含量(s)

表1 EGF mRNA在各组中的相对表达含量(s)

注:与对照组相比，*P＜0.05;与空白组比较，△P＜0.05，○P＞0.05。

组别 n K值实验组 6 1.264 ±0.359＊△0.830 ±0.121对照组 6 0.904 ±0.128○空白组6

K值=目的基因光密度值/β－actin光密度值，既各组EGFmRNA表达的相对含量。

图2 EGF mRNA在各组的表达

3 讨论

实验表明，盐酸川芎嗪用药组SD大鼠背部植皮区血管化明显，皮肤缺损修复后有弹性，为良性愈合;RT－PCR定量检测结果表明，实验组植皮区表皮生长因子(EGF)单位表达量明显高于对照组和空白组;而HE染色及VG特殊染色都观察到实验组血管化程度和胶原排列的完整性和规则度高于对照组［2］，明显高于空白组。因此可以认为，盐酸川芎嗪具有促进其植皮区血管化，有助于植皮的成活和良性愈合的作用。各组植皮区的EGF单位表达量虽然随植皮愈合时间的延长而下降，但在14天和21天这两个时间点，实验组EGF单位表达量均显著高于对照组和空白组，对照组和空白组之间的EGF单位表达量并无明显差异，提示盐酸川芎嗪可能是通过提高EGF的表达而达到促进植皮区生长及愈合的。

盐酸川芎嗪有效抑制血小板的聚集、减轻缺血－再灌注损伤后内皮细胞与白细胞的黏附及提高植皮区的微循环［6－8］，可能与其提高EGF的表达量具有协同作用［9］，一同完成植皮区早期血供的建立进而提高复合皮片的成活率，而盐酸川芎嗪抑制成纤维细胞的过度增殖，在前胶原基因的转录水平影响瘢痕成纤维细胞的胶原合成，从而减少瘢痕组织形成［10］，又有助于植皮成活后复合皮片的良性愈合，防止瘢痕的形成，进而达到修复与美观的双重目的，为临床治疗皮肤缺损提供了新的思路。

［1］Kang SW，Seo SW，Choi CY，et al.Porous poly(lactic － co － glycolic acid)microsphere as cell culture substrate and cell transplantation vehicle for adipose tissue engineering［J］.Tissue Eng Part C Methods.2008，14(1):25 －34.

［2］马绍英，李宝明，董丽.异种(猪)无细胞真皮基质的制备及体外生物相容性研究［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13(38):7424－7428.

［3］贾明，虞渝生.川芎嗪治疗大鼠缺血皮瓣的实验研究［J］.浙江中西医结合杂志，2007，17(4):205 －207.

［4］李有田，李赫，许丹，等.盐酸川芎嗪的药理作用及临床应用概述［J］.吉林中医药，2004，24(6):56 －68.

［5］陈海南，李沙，王兴立，等.大鼠静脉注射川芎嗪体内药动学研究［J］.中药材，2010，33(10):1599 －1602.

［6］李萍.盐酸川芎嗪药代动力学特征及临床应用［J］.现代中西医结合杂志，2005，14(12):1622 －1623.

［7］高长越，周华东，邓娟.川芎嗪对脑缺血再灌注损伤后细胞间黏附作用的影响［J］.中国中西医结合急救杂志，2002，9(3):135－136.

［8］马葆琛.川芎嗪治疗早期糖尿病肾病的临床观察［J］.中医药学报，2009，37(2):73 －74.

［9］李兰花，张艳丽，于娜.表皮生长因子及其受体在胎儿生长受限时的表达及川芎嗪的作用［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2007，5(1):34－36.

［10］郭海霞，吴延芳.川芎嗪和甘利欣对瘢痕成纤维细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达的影响［J］.中国中西医结合皮肤性病学杂志，2002，1(1):27 －30.