微透析技术监测大鼠脑损伤

毛 捷，徐善水，江晓春，陈建民，刘景平

(1.皖南医学院附属弋矶山医院 神经外科，安徽 芜湖 241001;2.中南大学湘雅医院 神经外科，湖南 长沙 410300)

颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是神经外科常见病，我国每年TBI的发病率为100～150人/10万人，占创伤病人总数的15%左右，病死率为创伤病人总数的85%［1］。损伤后的继发性损害是致残或死亡的重要原因，其发生机制尚不能完全阐明，目前研究认为，继发性损伤的发生与损伤后中枢神经系统生化物质的含量变化关系密切，有关颅脑损伤的研究很多，动物模型的制作也日趋完善［2］。本研究仿照经典的自由落体硬膜外撞击方法制作脑损伤模型，通过伤侧脑含水量测定和病理学改变观察模型复制是否成功，利用微透析技术收集损伤前后细胞外液(ECF)，探讨微透析技术在脑损伤后局部生化物质监测中的运用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 微透析装置购自美国Bioanalytical Systems公司，探针选择BR型，透析膜长4.0 mm，外直径0.5 mm，立体定向仪为西安西北光电仪器厂产品，动物呼吸机为浙江大学医学仪器厂生产，谷氨酸为美国BDH公司生产。

1.2 实验动物分组 健康雄性SD大鼠15只，中南大学湘雅医学院实验动物学部提供，清洁级，体重220～275 g，随机分为对照组及损伤组，损伤组包括轻伤组和重伤组，每组5只。

1.3 脑损伤动物模型制备 采用经典Feeney's自由落体硬膜外撞击方法［2］，10%水合氯醛(0.35/kg)腹腔内麻醉，气管切开，头部固定于立体定向仪，中线旁、人之缝前各2 mm右额骨磨成直径5 mm骨窗，保持硬膜完整。轻度和重度损伤的致伤力分别为200 g/cm和1 000 g/cm，撞击致伤后，呼吸机辅助呼吸，频率为85 次/min，吸∶呼 =1∶2，潮气量为6 ml，损伤前后15 min各取股动脉血行血气分析。对照组切开头皮和开骨窗，实验中保持肛温在(37.0±0.5)℃。

1.4 ECF的收集 灌注液选用Ringe's液，速度为2 μl/min。显微镜下切开硬脑膜，立体定向仪引导透析管置入脑内，深度4 mm。灌注1 h取得稳定的基础值，间隔15 min收集1次，伤前标本的平均值作为伤前基础值。伤后继续灌注2 h，-70℃保存待测。

1.5 Glu含量的测定 OPA柱前衍生HPLC荧光法检测，参照 Bianchi［3］的方法建立。ANASTAR 色谱工作站记录分析，峰面积外标法定量。

1.6 伤侧脑组织含水量的测定 断头取脑，去除小脑、脑干和嗅脑，取伤侧大脑半球，去除表面血液，分析天平称量湿重，置入110℃恒温烤箱24 h干燥至恒重，按Elliot公式计算脑含水量。

1.7 组织病理学检测 标本收集完成后，断头取脑，肉眼观察损伤差异，距损伤边缘0.5 cm各处取脑组织1块，常规固定切片，石蜡包埋，HE染色，光镜观察。

1.8 统计学分析 均采用SPSS 11.5统计软件进行分析。计量资料全部用均数±标准差(±s)表示，计量资料的比较采用t检验，各组之间的比较采用方差分析，以α=0.05为检验水准(双侧)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动脉血气分析 各组伤前和伤后动脉血气分析结果见表1。血气指标均在正常生理范围，无低氧及二氧化碳蓄积，伤前、后pH值、PaCO2及PaO2值差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组伤前、伤后的血气分析结果(mmHg，±s，n=15)Tab 1 The numerical value of blood gas analysis after traumatic brain injury(mmHg，±s，n=15)

表1 各组伤前、伤后的血气分析结果(mmHg，±s，n=15)Tab 1 The numerical value of blood gas analysis after traumatic brain injury(mmHg，±s，n=15)

对照组 轻度组 重度组pH PaO2 PaCO2 pH PaO2 PaCO2 pH PaO2 PaCO2 4±5.4 38.1±1.1 7.40±0.4 132.6±8.9 38.7±1.7伤后 7.41±0.05 132.8±6.3 39.2±2.1 7.40±0.07 131.2±7.8 37.7±1.2 7.41±0.3 130.9±9.3 39.1±2.2配对 t值 1.336 0.925 1.257 0.748 1.272 1.423 1.236 1.076 1.351 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.0伤前 7.40±0.02 132.7±7.7 39.2±2.2 7.40±0.02 131.5 ＞0.05

2.2 Glu含量的变化 对照组Glu基础水平为(2.17±0.23)μmol/L，各时间段变化很小，数值无明显变化(P＞0.05)。损伤组基础水平与对照组基本相同(P＞0.05)，损伤后两组Glu含量迅速升高，30 min达峰值，分别为(14.54±1.66)和(20.83±1.97)μmol/L，二者差异有统计学意义(P＜0.05)，其后逐渐下降。90 min后接近对照组。重伤组在15～75 min内高于对照组(P﹤0.05)，轻伤组在15～75 min内显著高于对照组，但低于重伤组(P﹤0.05，图1)。

图1 ECF中Glu水平的变化(μmol/L，±s，n=15)Fig 1 The dynamic varieties of glutamate concentration after traumatic brain injury(μmol/L，±s，n=15)

2.3 伤侧脑组织含水量 对照组脑组织含水量为(77.07±0.16)%，损伤组伤侧脑组织含水量与其相比均增高，如表2，各组之间比较，差异具有统计学意义﹙P＜0.05﹚。

表2 伤后2 h脑组织含水量(%，±s，n=15)Tab 2 Water content in the lateral brain within 2 hour of traumatic brain injury(%，±s，n=15)

表2 伤后2 h脑组织含水量(%，±s，n=15)Tab 2 Water content in the lateral brain within 2 hour of traumatic brain injury(%，±s，n=15)

注:与对照组比较，﹡P＜0.05;伤组比较，﹟P＜0.05

组别 脑组织含水量对照组0.000 77.07±0.16轻伤组 78.90±0.24﹡重伤组 81.55±0.57﹡﹟F 值 186.5 P值

2.4 肉眼观察损伤程度 如图2所示，轻伤组可见脑皮层损伤，蛛网膜下腔出血，重伤组见局部明显挫裂伤灶，两者比较可见明显差异。

2.5 组织病理学观察 对照组脑皮质锥体细胞分布密集，结构良好;轻伤组皮质锥体细胞数量减少，组织疏松，出现呈固缩浓染的锥体细胞;重伤组皮质锥体细胞分布稀疏，结构紊乱，部分胞核偏位，可见大量空泡区(见图3)。

图2 肉眼下大鼠脑损伤程度Fig 2 Gross view of brain injury level

图3 大鼠大脑皮层HE染色(×400)Fig 3 The patho-chng of cerebral cortex by hematoxylin-eosin staining(×400)

3 讨论

3.1 脑损伤模型的制作合理性 颅脑损伤是神经外科常见病，致残率和病死率高，如何有效地防治创伤引起的继发性损伤是改善病人预后的关键。有关脑损伤的研究很多，动物模型的制作也日趋完善。目前研究认为雌激素对各种因素造成的神经细胞的损害具有保护作用，主要通过作用于各种雌激素受体，调控细胞凋亡途径中的保护性基因，同时作用于神经胶质细胞使其表达各种细胞因子而起到保护作用［8，9］。本研究选择SD雄性大鼠，受雌激素周期变化影响小，可以排除雌激素水平对实验结果的影响。仿照经典自由落体撞击硬脑膜造成损伤模型，具有操作简单、影响因素单纯的优点。从图2可见，肉眼下直观地显示不同的冲击力造成的大鼠皮质局部损伤差异很明显。表2显示随着损伤程度增加脑组织含水量明显增加，两组差异比较具有统计学意义(P＜0.05);病理学检测结果和对照组比较，轻伤组皮质锥体细胞大部分形态正常，可见少量细胞浓染，但结构尚存;重伤组皮质锥体细胞损害加重，可见大量空泡区，部分神经细胞缺失。肉眼观察损伤面积的大小及程度，脑组织水含量测定和组织病理改变均证实本模型造成局灶性脑损伤复制成功，实验操作过程中体会该模型简易可靠，成功率高。

3.2 微透析技术在脑损伤模型的应用 脑损伤的生化研究是神经科学研究中的一个重要方面，以往多采用分析脑匀浆、脑脊液中的生化物质含量进行研究，这些方法不能动态反映活体ECF中生化物质的变化。ECF是神经细胞直接生存的内环境，细胞功能和代谢的变化常引起ECF中生化物质的改变，检测ECF的生化物质含量对研究脑的病理生理有重要作用。微透析技术可以持续进行ECF动态采样，适用于脑的生理病理研究［4］。微透析管由多碳聚合物半透膜组成，具有选择性物质双向交换作用，扩散方向取决于管内外该物质的相对浓度。由于透析管中的灌流液不断流动更新，导致跨膜浓度梯度始终存在，微透析持续进行。收集灌流液，测定其中的待测物质含量，就可监测该物质的含量变化。因此，微透析技术可持续检测脑损伤前后损伤局部ECF中生化物质水平，透析液内不含酶等大分子物质，不仅可防止样品中的化学物质被酶降解，且无需去蛋白等常规的前处理工作，直接注入分析仪器进行检测［5，6］。

微透析技术是有创检测方法，Landolt H等［7］计算膜长4 mm、直径0.5 mm的透析管插入的损伤范围只有0.75～1.5 mm3大小。本研究选择Ringe's液为灌注液，采用低速率灌注，观察到微透析管插入脑组织前后对局部ECF中Glu含量影响很小(见图1)，表明了微透析方法本身对脑组织的干扰很小，其差异没有统计学意义(P＞0.05)。本研究模型微透析管的插入在颅骨开窗后直视下进行，可避开血管，收集端可置于脑的指定部位，检测的生化物质含量反映了损伤部位的变化，排除了非损伤区影响。可以推断在脑损伤局部生化物质的动态研究中，微透析技术是一种较理想的方法。

继发性损伤的形成机制，目前还不完全清楚。目前的研究认为ECF中兴奋性氨基酸(EAA)增多可反映细胞缺血或损伤的程度［10］。EAA可充当反映脑损伤预后的生化标志［11］。本研究观察到损伤组Glu基础水平与对照组基本相同，伤后迅速升高，30 min内达峰值，两组分别是基础水平的6.7和9.6倍，两者比较具有统计学意义﹙P＜0.05，如图1﹚，进一步证实本损伤模型轻伤组和重伤组之间的差异具有统计学意义。

综上所述，利用微透析技术动态监测ECF中生化物质的变化为脑神经保护的研究提供了新的方法，而动物模型的合理制作是研究的前提，本研究成功制作大鼠脑损伤的动物模型及微透析技术的采用，为随后的研究打下了实验基础。

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